项目开展背景： 系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及多器官、多系统，临床表现复杂，病程迁延反复的自身免疫性疾病，我国患病率为40～70/10万，初步估计约有100万患者。SLE发病机理尚不明了，有证据表明遗传因素在其中起主导作用：1)同卵双生子发病的一致率(25%～70%)明显高于异卵双生子(2%～10%)；2)发病有家族聚集倾向，一级亲属的发病率明显高于正常人群，但至今尚无自身免疫病通过个体间血液传播的证据；3)迄今尚未发现某一特定外源性感染源与疾病发病明确关联；4)自发性SLE动物模型的遗传背景研究发现多种免疫调节异常表型与特定的基因位点相关联。由于遗传因素与SLE发病密切相关，解析疾病易感基因，能够发现特异性作用药物，建立基因早期诊断方法，对该病的防治具有重要意义。 遗传标记是进行遗传学研究的主要工具，这些多态性标记可直接改变氨基酸组成而影响功能，或本身无生物学功能但位置与某个易感基因接近。目前常用的遗传标记主要有微卫星和单核苷酸多态性(SNP)两大类。微卫星是基因组DNA上短核苷酸片段串联的重复序列，可由二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸进行可变数目的重复串联构成，选择微卫星时不仅要考虑它的位置，还要看其长度多态性的变异程度，一个标记的信息量大小取决于它的长度多态性。SNP为新一代的遗传学标记，指基因组中单个核苷酸的变异，与微卫星相比，SNP数量众多，分布更密集，可用于更精细的定位研究；但其杂合度低，所含信息量少。实际工作中可将这两类遗传标记结合起来加以检测。 与简单的孟德尔遗传模式不同，SLE的遗传模式复杂，有多个基因参入，加之可能与环境因素存在相互作用，增大了对其进行遗传研究的难度。全基因扫描为发现狼疮主要致病基因提供了良好的研究手段，从最初以数百对微卫星标记进行全基因扫描连锁分析，到2008年报道以数十万个SNP标记进行病例对照分析，均显示人16号染色体p12.3～q12.2区域存在狼疮相关位点。可是，这一区域内存在200多个基因，需要进行精细定位以缩小候选基因范围。基因精细定位主要依赖于基因组中不同位点间存在的非随机关联，即连锁不平衡。在进行研究时，为控制病例对照研究中混杂的族群效应和人群分层对结果的影响，多应用以家系为基础的对照。这类方法中最常用的是传递不平衡检验(TDT)，其主要优点是最大限度利用了患者父母资料，既用于检验又构成对照，消除了群体的影响。 SLE具有多种免疫学异常，而以B淋巴细胞异常活化并产生大量自身抗体为主要特征。抗核抗体是以细胞的核成分（DNA、RNA、蛋白质和酶）为靶抗原的自身抗体的总称，见于95%以上的SLE患者。在这些抗体中，抗双链DNA抗体对SLE具有很高的特异性，抗Sm则是SLE的特异性抗体，两者均成为该病的诊断指标。自身抗体是SLE重要的发病基础和临床指标，但其产生的根源目前尚不清楚。通过一系列研究，本课题组首次揭示OAZ基因是人16号染色体上的SLE致病基因，并弄清该基因与抗核抗体异常产生相关，这一SLE中全新致病通路的发现将对彻底阐明疾病发生机制起到促进和推动作用。 研究内容： 1.16号染色体精细定位研究 人类全基因组扫描发现6个显著的SLE相关染色体区域，其中一个位于16号染色体60厘摩尔根附近，与其他自身免疫病易感位点接近，提示在该区可能存在重要的致病基因。为明确16号染色体与中国人群SLE相关性并进行候选基因定位，我们应用遗传距离位于57.79～65.1厘摩尔根的5对微卫星标记(D16s540、D16s409、D16s517、D16s3136、D16s416)对157个SLE家系进行了定位研究，结果D16S409及D16S517与SLE存在传递不平衡，其中尤以D16S517最为显著(P＜0.0001)。D16S517中，271bp等位基因优先传递给患病子代，277bp等位基因则优先传递给正常子代。 为验证上述结果，我们将微卫星标记增加至8对（物理距离47218Kbp～52919Kbp），家系数扩大至288个，DNA扩增产物经DNA测序仪电泳，以Genescan软件收集数据进行基因分型，并通过ETDT及Genehunter进行连锁不平衡分析后仍得到相同的结论，强力证实人类SLE在16号染色体上存在疾病遗传主效基因。 2.OAZ SNP分析及基因表达研究 D16s517位于OAZ(OLF1/EBF-associated zinc finger protein)基因内部，根据TDT分析随遗传标记与疾病基因距离的增大相关性迅速降低的特点，OAZ有可能是该区域的狼疮致病基因。为此，我们选择阳性微卫星标记附近10个SNP以SNaPShot方法进行验证，并选择其中5个杂合度较高的SNP对244个SLE家系进行等位基因分型，以Genehunter软件分析单个位点及单倍型传递情况。结果由rs1344531-rs2080353-rs933564-rs1345431构成的单倍型T-A-G-G与疾病有较弱连锁(p=0.04)，而rs933564-D16s517构成的单倍型G-271bp、rs2080353-rs933564-D16s517构成的单倍型A-G-271bp优势传递给患者(p=0.000000和0.000002)，rs2080353-rs933564-D16s517-rs1345431构成的单倍型A-G-271bp-G也优势传递给患者(p=0.0084)。 应用实时定量PCR检测OAZ基因表达，结果发现SLE患者中该基因表达水平高于正常对照，并且具有A-G-271bp-G单倍型纯合子的患者基因表达水平高于非纯合子患者。 3.OAZ基因高表达与疾病活动性及自身抗体的关联性 通过对40例SLE、18例类风湿关节炎和30例正常对照进行外周血OAZ基因表达检测，我们发现该基因在SLE患者中的表达不仅高于正常对照(p＜ 0.0001)，也较类风湿关节炎患者中增高(p＜0.01)。以SLE疾病活动指数(SLEDAI)评估狼疮患者疾病活动性，与OAZ表达的对数值（因为基因表达值过于分散，故转换成对数值）进行相关分析，发现两者间存在密切的正相关（r=0.72，p＜0.0001，如图3所示）。在最初的研究中未能显示OAZ基因表达与疾病活动关联，考虑与资料为回顾性收集及数据未做转换有关。此外，我们还以造血干/祖细胞预富集试剂收集5例SLE患者骨髓前体细胞，与5例正常人骨髓对照样本相比，OAZ基因表达水平也明显增高且与疾病活动性和肾脏损伤指数相关。 40例SLE患者均为抗核抗体阳性，其中15例抗dsDNA抗体阳性，19例抗Sm抗体阳性，抗SSA、SSB、U1RNP抗体阳性者各有18、14和9例。我们发现，OAZ表达水平在抗dsDNA抗体、抗Sm抗体阳性患者中增高，而与抗SSA、SSB、U1RNP抗体无关。 4.OAZ基因沉默对自身抗体的影响 体内研究显示OAZ与自身抗体产生相关，为证实OAZ确实可调控抗体的产生，我们采用新型的RNA干扰技术(Accell siRNA)对OAZ进行基因沉默。OAZ siRNA能成功使该基因表达降低70%以上，收集培养上清检测免疫球蛋白水平，结果IgG有明显下降；以ELISA和免疫荧光法进行抗体水平检测，均显示抗核抗体滴度明显减低，同时OAZ基因表达抑制率与抗核抗体滴度变化成正比。 5.OAZ基因的作用通路 OAZ属于C2H2锌指蛋白家族，一般认为该基因在骨形态发生蛋白(BMP)信号通路中发挥作用。BMP与相应细胞表面受体结合后，可活化受体调控Smad (R-Smad)，其后R-Smad与共同Smad (Co-Smad)形成复合物后进入细胞核内与DNA结合，调控靶基因转录。OAZ在这一过程中作为共激活分子与Smad复合物及DNA结合，提高Smad与后者的亲和力，增强R-Smad转录活性。OAZ的具体调控靶点尚不清楚，目前有研究显示分化抑制因子(Id)和抑制性Smad(Smad6)是可能受BMP通路调控；人类共存在4种Id蛋白(Id1-4)，在动物模型中Id3基因敲除后B细胞出现增生缺陷，提示这类基因具有免疫学功能。 为弄清OAZ的作用通路，我们检测了外周血中BMP4、BMP6、Id3和Smad6的表达水平，结果除Smad6外，其余三个基因均存在差异表达；但以骨髓前体细胞进行验证时，仅Id3在SLE患者中高表达。进一步分析后发现Id3表达水平也与SLE疾病活动性及抗dsDNA、抗Sm抗体相关。 在OAZ基因沉默后，Id1-3基因表达均明显降低，证实OAZ对Id基因具有调控能力。同时，外周血单个核细胞分泌IFNγ、IL10、IL12、IL21水平降低，分泌CCl2水平增高，提示这些细胞因子与趋化因子在OAZ－Id信号通路促进自身抗体的产生过程中发挥作用。 创新点： 1)既往尚无研究发现OAZ与系统性红斑狼疮发病相关，也缺乏对该基因的功能研究； 2)课题组在国内外首先报道OAZ为16号染色体上系统性红斑狼疮易感基因，并阐明该基因在功能上与自身抗体这一免疫病发病基础关联，Id蛋白在其致病通路中起作用。 发表论文： 1)中国人群16号染色体q12区存在系统性红斑狼疮易感基因。中华医学遗传学杂志2003;20(1):27～30。（EI收录）PMID:12579495 2)系统性红斑狼疮患者16号染色体候选基因表达研究。中华皮肤科杂志2003;36(6):322～324。 3)系统性红斑狼疮患者16q12精细定位研究。中华风湿病学杂志2004;8(8) 454～457。（第三届中国科协期刊优秀学术论文） 4)中国人群系统性红斑狼疮患者OAZ基因多态性研究。中华医学遗传学杂志2004;21(5):430～434。（EI收录）PMID:15476163 5)系统性红斑狼疮OAZ通路基因表达研究。中华医学杂志2009;89(29):2068～2071。PMID:20017333 6)Olf1/EBF associated zinc finger protein interfered with antinuclear antibody production in patients with systemic lupus erythematosus.Arthritis Res Ther.2010;12(2):R59.PMID: 20359360。 7)siRNA阻断OAZ信号通路对狼疮抗核抗体产生的影响。中华风湿病学杂志2010;14(1):3～7。 引文情况： 已被SCI文献引用7次。

项目开展背景： 系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及多器官、多系统，临床表现复杂，病程迁延反复的自身免疫性疾病，我国患病率为40～70/10万，初步估计约有100万患者。SLE发病机理尚不明了，有证据表明遗传因素在其中起主导作用：1)同卵双生子发病的一致率(25%～70%)明显高于异卵双生子(2%～10%)；2)发病有家族聚集倾向，一级亲属的发病率明显高于正常人群，但至今尚无自身免疫病通过个体间血液传播的证据；3)迄今尚未发现某一特定外源性感染源与疾病发病明确关联；4)自发性SLE动物模型的遗传背景研究发现多种免疫调节异常表型与特定的基因位点相关联。由于遗传因素与SLE发病密切相关，解析疾病易感基因，能够发现特异性作用药物，建立基因早期诊断方法，对该病的防治具有重要意义。 遗传标记是进行遗传学研究的主要工具，这些多态性标记可直接改变氨基酸组成而影响功能，或本身无生物学功能但位置与某个易感基因接近。目前常用的遗传标记主要有微卫星和单核苷酸多态性(SNP)两大类。微卫星是基因组DNA上短核苷酸片段串联的重复序列，可由二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸进行可变数目的重复串联构成，选择微卫星时不仅要考虑它的位置，还要看其长度多态性的变异程度，一个标记的信息量大小取决于它的长度多态性。SNP为新一代的遗传学标记，指基因组中单个核苷酸的变异，与微卫星相比，SNP数量众多，分布更密集，可用于更精细的定位研究；但其杂合度低，所含信息量少。实际工作中可将这两类遗传标记结合起来加以检测。 与简单的孟德尔遗传模式不同，SLE的遗传模式复杂，有多个基因参入，加之可能与环境因素存在相互作用，增大了对其进行遗传研究的难度。全基因扫描为发现狼疮主要致病基因提供了良好的研究手段，从最初以数百对微卫星标记进行全基因扫描连锁分析，到2008年报道以数十万个SNP标记进行病例对照分析，均显示人16号染色体p12.3～q12.2区域存在狼疮相关位点。可是，这一区域内存在200多个基因，需要进行精细定位以缩小候选基因范围。基因精细定位主要依赖于基因组中不同位点间存在的非随机关联，即连锁不平衡。在进行研究时，为控制病例对照研究中混杂的族群效应和人群分层对结果的影响，多应用以家系为基础的对照。这类方法中最常用的是传递不平衡检验(TDT)，其主要优点是最大限度利用了患者父母资料，既用于检验又构成对照，消除了群体的影响。 SLE具有多种免疫学异常，而以B淋巴细胞异常活化并产生大量自身抗体为主要特征。抗核抗体是以细胞的核成分（DNA、RNA、蛋白质和酶）为靶抗原的自身抗体的总称，见于95%以上的SLE患者。在这些抗体中，抗双链DNA抗体对SLE具有很高的特异性，抗Sm则是SLE的特异性抗体，两者均成为该病的诊断指标。自身抗体是SLE重要的发病基础和临床指标，但其产生的根源目前尚不清楚。通过一系列研究，本课题组首次揭示OAZ基因是人16号染色体上的SLE致病基因，并弄清该基因与抗核抗体异常产生相关，这一SLE中全新致病通路的发现将对彻底阐明疾病发生机制起到促进和推动作用。 研究内容： 1.16号染色体精细定位研究 人类全基因组扫描发现6个显著的SLE相关染色体区域，其中一个位于16号染色体60厘摩尔根附近，与其他自身免疫病易感位点接近，提示在该区可能存在重要的致病基因。为明确16号染色体与中国人群SLE相关性并进行候选基因定位，我们应用遗传距离位于57.79～65.1厘摩尔根的5对微卫星标记(D16s540、D16s409、D16s517、D16s3136、D16s416)对157个SLE家系进行了定位研究，结果D16S409及D16S517与SLE存在传递不平衡，其中尤以D16S517最为显著(P＜0.0001)。D16S517中，271bp等位基因优先传递给患病子代，277bp等位基因则优先传递给正常子代。 为验证上述结果，我们将微卫星标记增加至8对（物理距离47218Kbp～52919Kbp），家系数扩大至288个，DNA扩增产物经DNA测序仪电泳，以Genescan软件收集数据进行基因分型，并通过ETDT及Genehunter进行连锁不平衡分析后仍得到相同的结论，强力证实人类SLE在16号染色体上存在疾病遗传主效基因。 2.OAZ SNP分析及基因表达研究 D16s517位于OAZ(OLF1/EBF-associated zinc finger protein)基因内部，根据TDT分析随遗传标记与疾病基因距离的增大相关性迅速降低的特点，OAZ有可能是该区域的狼疮致病基因。为此，我们选择阳性微卫星标记附近10个SNP以SNaPShot方法进行验证，并选择其中5个杂合度较高的SNP对244个SLE家系进行等位基因分型，以Genehunter软件分析单个位点及单倍型传递情况。结果由rs1344531-rs2080353-rs933564-rs1345431构成的单倍型T-A-G-G与疾病有较弱连锁(p=0.04)，而rs933564-D16s517构成的单倍型G-271bp、rs2080353-rs933564-D16s517构成的单倍型A-G-271bp优势传递给患者(p=0.000000和0.000002)，rs2080353-rs933564-D16s517-rs1345431构成的单倍型A-G-271bp-G也优势传递给患者(p=0.0084)。 应用实时定量PCR检测OAZ基因表达，结果发现SLE患者中该基因表达水平高于正常对照，并且具有A-G-271bp-G单倍型纯合子的患者基因表达水平高于非纯合子患者。 3.OAZ基因高表达与疾病活动性及自身抗体的关联性 通过对40例SLE、18例类风湿关节炎和30例正常对照进行外周血OAZ基因表达检测，我们发现该基因在SLE患者中的表达不仅高于正常对照(p＜ 0.0001)，也较类风湿关节炎患者中增高(p＜0.01)。以SLE疾病活动指数(SLEDAI)评估狼疮患者疾病活动性，与OAZ表达的对数值（因为基因表达值过于分散，故转换成对数值）进行相关分析，发现两者间存在密切的正相关（r=0.72，p＜0.0001，如图3所示）。在最初的研究中未能显示OAZ基因表达与疾病活动关联，考虑与资料为回顾性收集及数据未做转换有关。此外，我们还以造血干/祖细胞预富集试剂收集5例SLE患者骨髓前体细胞，与5例正常人骨髓对照样本相比，OAZ基因表达水平也明显增高且与疾病活动性和肾脏损伤指数相关。 40例SLE患者均为抗核抗体阳性，其中15例抗dsDNA抗体阳性，19例抗Sm抗体阳性，抗SSA、SSB、U1RNP抗体阳性者各有18、14和9例。我们发现，OAZ表达水平在抗dsDNA抗体、抗Sm抗体阳性患者中增高，而与抗SSA、SSB、U1RNP抗体无关。 4.OAZ基因沉默对自身抗体的影响 体内研究显示OAZ与自身抗体产生相关，为证实OAZ确实可调控抗体的产生，我们采用新型的RNA干扰技术(Accell siRNA)对OAZ进行基因沉默。OAZ siRNA能成功使该基因表达降低70%以上，收集培养上清检测免疫球蛋白水平，结果IgG有明显下降；以ELISA和免疫荧光法进行抗体水平检测，均显示抗核抗体滴度明显减低，同时OAZ基因表达抑制率与抗核抗体滴度变化成正比。 5.OAZ基因的作用通路 OAZ属于C2H2锌指蛋白家族，一般认为该基因在骨形态发生蛋白(BMP)信号通路中发挥作用。BMP与相应细胞表面受体结合后，可活化受体调控Smad (R-Smad)，其后R-Smad与共同Smad (Co-Smad)形成复合物后进入细胞核内与DNA结合，调控靶基因转录。OAZ在这一过程中作为共激活分子与Smad复合物及DNA结合，提高Smad与后者的亲和力，增强R-Smad转录活性。OAZ的具体调控靶点尚不清楚，目前有研究显示分化抑制因子(Id)和抑制性Smad(Smad6)是可能受BMP通路调控；人类共存在4种Id蛋白(Id1-4)，在动物模型中Id3基因敲除后B细胞出现增生缺陷，提示这类基因具有免疫学功能。 为弄清OAZ的作用通路，我们检测了外周血中BMP4、BMP6、Id3和Smad6的表达水平，结果除Smad6外，其余三个基因均存在差异表达；但以骨髓前体细胞进行验证时，仅Id3在SLE患者中高表达。进一步分析后发现Id3表达水平也与SLE疾病活动性及抗dsDNA、抗Sm抗体相关。 在OAZ基因沉默后，Id1-3基因表达均明显降低，证实OAZ对Id基因具有调控能力。同时，外周血单个核细胞分泌IFNγ、IL10、IL12、IL21水平降低，分泌CCl2水平增高，提示这些细胞因子与趋化因子在OAZ－Id信号通路促进自身抗体的产生过程中发挥作用。 创新点： 1)既往尚无研究发现OAZ与系统性红斑狼疮发病相关，也缺乏对该基因的功能研究； 2)课题组在国内外首先报道OAZ为16号染色体上系统性红斑狼疮易感基因，并阐明该基因在功能上与自身抗体这一免疫病发病基础关联，Id蛋白在其致病通路中起作用。 发表论文： 1)中国人群16号染色体q12区存在系统性红斑狼疮易感基因。中华医学遗传学杂志2003;20(1):27～30。（EI收录）PMID:12579495 2)系统性红斑狼疮患者16号染色体候选基因表达研究。中华皮肤科杂志2003;36(6):322～324。 3)系统性红斑狼疮患者16q12精细定位研究。中华风湿病学杂志2004;8(8) 454～457。（第三届中国科协期刊优秀学术论文） 4)中国人群系统性红斑狼疮患者OAZ基因多态性研究。中华医学遗传学杂志2004;21(5):430～434。（EI收录）PMID:15476163 5)系统性红斑狼疮OAZ通路基因表达研究。中华医学杂志2009;89(29):2068～2071。PMID:20017333 6)Olf1/EBF associated zinc finger protein interfered with antinuclear antibody production in patients with systemic lupus erythematosus.Arthritis Res Ther.2010;12(2):R59.PMID: 20359360。 7)siRNA阻断OAZ信号通路对狼疮抗核抗体产生的影响。中华风湿病学杂志2010;14(1):3～7。 引文情况： 已被SCI文献引用7次。