基因治疗目前有希望成为治愈某些遗传性疾病、恶性肿瘤、病毒感染等疾病的有效措施。其中载体系统的研究在一定程度上制约着治疗水平的提高。来源于人类免疫缺陷病毒-1的慢病毒载体由于能够感染非分裂期细胞和携带外源基因能力大等特点越来越受到研究者的重视。 　　本研究的第一部分构建来源于人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）慢病毒载体的三质粒包装系统（包膜蛋白质粒、包装质粒和转移质粒），重点对转移质粒进行改造，通过引入PPT元件和更换其中的内部启动子，并以绿色荧光蛋白（GFP）作为标志基因，对三质粒系统进行包装后观察GFP是否能够获得表达。初步比较4种内部启动子驱动GFP表达的效率。结果成功构建了含PPT元件和不同内部启动子的慢病毒载体，四种启动子的效率以CMV启动子效率最高，LSP启动子较弱，PUB介于两者之间。 　　由于在异基因造血干细胞移植中，移植物抗宿主病（GVHD）是制约其临床应用的最大并发症，而目前常用的去除T细胞的移植和免疫抑制剂都不能获得理想的临床效果。在本研究的第二部分，利用第一部分工作筛选出的表达效率较高的慢病毒载体，利用其携带HSV1-TK/HSV1-SR39TK-GCV/ACV自杀基因系统在体内、体外两个水平研究对小鼠急性移植物抗宿主病（GVHD）的防治作用。结果成功构建了HSV1-TK/HSV1-SR39TK基因工程T细胞，不同启动子对慢病毒载体在293T细胞的转染效率、转导自杀基因在T淋巴细胞内的表达均有影响；HSV1-SR39TK+T细胞对GCV和ACV的敏感性高于TK+T细胞。体内实验中，HSV1-TK/GCV系统能够有效控制小鼠急性GVHD，且早期用药效果优于发生GVHD后治疗性用药。 　　血友病A的治疗目前仍以替代治疗为主，但是其存在感染肝炎、AIDS的风险以及治疗费用昂贵、反复输注后产生抑制性抗体导致输注无效等缺陷，因此在本系列研究的第三部分，构建含B区缺失的FⅧ基因的慢病毒载体，在体外观察慢病毒载体是否能够介导FⅧ在体外的有效表达。结果发现携带FⅧ的慢病毒载体在体外可以有效感染靶细胞并表达有活性的FⅧ，为慢病毒载体用于血友病基因治疗奠定了基础。 　　由于慢病毒载体具有能够感染非分裂期细胞和载体容量大、免疫原性小等特点越来越受到研究者的关注，目前对于慢病毒载体的改造集中在几个方面，包括提高其生物安全性、提高目的基因的表达效率以及基因表达的调控和设计靶向性载体等。其中以提高目的基因的表达效率研究最为活跃。在目前常用的慢病毒三质粒包装系统中，改造最多的是对转移质粒的改造，我们通过近几年的研究工作，主要通过在转移质粒中引入PPT元件和不同的内部启动子，筛选到表达效率较高的转移质粒，并将其应用于携带不同的目的基因如单纯疱疹胸苷激酶基因（HSV1-TK）和凝血因子Ⅷ，在体内和体外实验研究了HSV1-TK/HSV1-SR39TK-GCV/ACV自杀基因系统对于小鼠急性移植物抗宿主病防治的研究，获得了较为满意的结果，为GVHD防治研究提供了新的思路；同时，在体外不同的细胞中获得了FⅧ的表达，为血友病A的基因治疗奠定了一定的基础。 　　本课题组近年来一直围绕慢病毒载体开展了相关的研究工作，这项工作在国内起步较早，所获得的慢病毒载体包装后病毒滴度高，转染效率强，国内多家研究单位来电来函索要该载体系统，对于推动国内病毒载体的研究工作起到了积极的作用。 　　进一步的工作主要是拓展慢病毒载体的应用范围，包括发展慢病毒载体的四质粒系统，以进一步增加该载体的安全性；同时将其应用于携带其他更多的目的基因用于实验研究，如siRNA等的相关研究。另外，在GVHD的防治研究中，更深入研究突变型HSV1-TK/GCV（ACV）系统的作用，筛选出毒副作用较小的前体药物；对于血友病A的基因治疗争取进行动物实验研究。在国内和更多的兄弟单位进行慢病毒载体研究的交流和合作，力争使本课题组在该研究领域保持国内领先水平。

　　基因治疗目前有希望成为治愈某些遗传性疾病、恶性肿瘤、病毒感染等疾病的有效措施。其中载体系统的研究在一定程度上制约着治疗水平的提高。来源于人类免疫缺陷病毒-1的慢病毒载体由于能够感染非分裂期细胞和携带外源基因能力大等特点越来越受到研究者的重视。 　　本研究的第一部分构建来源于人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）慢病毒载体的三质粒包装系统（包膜蛋白质粒、包装质粒和转移质粒），重点对转移质粒进行改造，通过引入PPT元件和更换其中的内部启动子，并以绿色荧光蛋白（GFP）作为标志基因，对三质粒系统进行包装后观察GFP是否能够获得表达。初步比较4种内部启动子驱动GFP表达的效率。结果成功构建了含PPT元件和不同内部启动子的慢病毒载体，四种启动子的效率以CMV启动子效率最高，LSP启动子较弱，PUB介于两者之间。 　　由于在异基因造血干细胞移植中，移植物抗宿主病（GVHD）是制约其临床应用的最大并发症，而目前常用的去除T细胞的移植和免疫抑制剂都不能获得理想的临床效果。在本研究的第二部分，利用第一部分工作筛选出的表达效率较高的慢病毒载体，利用其携带HSV1-TK/HSV1-SR39TK-GCV/ACV自杀基因系统在体内、体外两个水平研究对小鼠急性移植物抗宿主病（GVHD）的防治作用。结果成功构建了HSV1-TK/HSV1-SR39TK基因工程T细胞，不同启动子对慢病毒载体在293T细胞的转染效率、转导自杀基因在T淋巴细胞内的表达均有影响；HSV1-SR39TK+T细胞对GCV和ACV的敏感性高于TK+T细胞。体内实验中，HSV1-TK/GCV系统能够有效控制小鼠急性GVHD，且早期用药效果优于发生GVHD后治疗性用药。 　　血友病A的治疗目前仍以替代治疗为主，但是其存在感染肝炎、AIDS的风险以及治疗费用昂贵、反复输注后产生抑制性抗体导致输注无效等缺陷，因此在本系列研究的第三部分，构建含B区缺失的FⅧ基因的慢病毒载体，在体外观察慢病毒载体是否能够介导FⅧ在体外的有效表达。结果发现携带FⅧ的慢病毒载体在体外可以有效感染靶细胞并表达有活性的FⅧ，为慢病毒载体用于血友病基因治疗奠定了基础。 　　由于慢病毒载体具有能够感染非分裂期细胞和载体容量大、免疫原性小等特点越来越受到研究者的关注，目前对于慢病毒载体的改造集中在几个方面，包括提高其生物安全性、提高目的基因的表达效率以及基因表达的调控和设计靶向性载体等。其中以提高目的基因的表达效率研究最为活跃。在目前常用的慢病毒三质粒包装系统中，改造最多的是对转移质粒的改造，我们通过近几年的研究工作，主要通过在转移质粒中引入PPT元件和不同的内部启动子，筛选到表达效率较高的转移质粒，并将其应用于携带不同的目的基因如单纯疱疹胸苷激酶基因（HSV1-TK）和凝血因子Ⅷ，在体内和体外实验研究了HSV1-TK/HSV1-SR39TK-GCV/ACV自杀基因系统对于小鼠急性移植物抗宿主病防治的研究，获得了较为满意的结果，为GVHD防治研究提供了新的思路；同时，在体外不同的细胞中获得了FⅧ的表达，为血友病A的基因治疗奠定了一定的基础。 　　本课题组近年来一直围绕慢病毒载体开展了相关的研究工作，这项工作在国内起步较早，所获得的慢病毒载体包装后病毒滴度高，转染效率强，国内多家研究单位来电来函索要该载体系统，对于推动国内病毒载体的研究工作起到了积极的作用。 　　进一步的工作主要是拓展慢病毒载体的应用范围，包括发展慢病毒载体的四质粒系统，以进一步增加该载体的安全性；同时将其应用于携带其他更多的目的基因用于实验研究，如siRNA等的相关研究。另外，在GVHD的防治研究中，更深入研究突变型HSV1-TK/GCV（ACV）系统的作用，筛选出毒副作用较小的前体药物；对于血友病A的基因治疗争取进行动物实验研究。在国内和更多的兄弟单位进行慢病毒载体研究的交流和合作，力争使本课题组在该研究领域保持国内领先水平。