任务来源： 　　青岛市科技发展计划。 　　随着医学的进步，外科技术的不断发展，许多复杂的先天性心脏病或大血管疾病都需要采用心外管道重建有效的血液循环。但迄今为止尚没有理想的血管替代材料。早期主要用合成材料（如涤纶等）替代血管进行治疗，但疗效不理想，常出现诸如栓塞，感染，钙化等许多并发症。更有甚者合成材料植入人体后不能生长，无法满足小儿生长发育要求，许多患者术后数年内需再次手术置换。 　　据流行病学调查结果，我国先心病的发病率为7～8‰，随着先心外科技术的发展，越来越多的复杂先心病可以通过手术纠治，而目前的状况是，很多患儿因无合适的心外管道而失去了手术纠治的机会；即使部分患儿有幸获得了手术治疗，其中相当一部分患者又因管道不能适应生长需要或钙化、阻塞等原因需再次甚至多次手术，极大地增加了手术危险性，加重了患儿痛苦及家庭、社会负担。因此如何解决血管替代物诸多缺陷，是一项非常迫切的科研任务。 　　本课题组设想在我们前期研究所取得的成果及经验的基础上，依托青岛大学医学院细胞培养实验室在干细胞研究方面的雄厚技术力量，跟上国外血管组织工程研究的最新方向，通过培养平滑肌细胞和成纤维细胞，以及分离外周血获得内皮祖细胞，体外定向分化，培养和扩增出血管内皮细胞，以此制备出组织工程血管，然后通过显微外科方法，并将制备的组织工程血管移植至供体猪，观察组织工程血管的生长和通畅性；内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞及ECM之间在体内或体外的相互影响。自体平滑肌细胞、成纤维细胞和外周血内皮祖细胞取材容易，扩增数量大，无免疫排斥及伦理道德问题等优点。这一研究的实施，有助于在细胞及分子水平进行全生物化组织工程血管的构建研究。 　　1.外周血中富含内皮祖细胞组分的分离：按照密度梯度离心法，用淋巴细胞分离液分离得到。 　　2.内皮祖细胞的体外培养和扩增：利用IMDM培养液，改变血清、VEGF、bFGF的浓度，来扩增EPC。 　　3.EPC的鉴定：采用DiU-acLDL 和lectin-UEA-1双标记来鉴定。 　　4.平滑肌细胞的分离、培养、鉴定：组织块培养方法，利用DMDM培养液，检测a-肌动蛋白、透射电镜检测。 　　5.血管脱细胞组织基质的制备：0.125﹪胰酶消化颈总动脉5cm。 　　6.培养得到组织工程血管。 　　7.血管移植。 　　8.术后进行Doppler超声检查观察血管通畅情况，并在第15天、30天 、60天随机取血管进行组织学观察。并对移植物进行功能分析。 　　近年来，组织工程(Tissue Engineering)技术的发展为解决这一问题提供了新的思路。组织工程血管是一种用组织工程学的方法构建的具有良好的生物相容性和力学特性的血管替代物。人造血管的发明及其内表面的改性处理为组织工程血管的研究奠定了坚实的基础。组织工程血管的基本构件是血管支架和种子细胞，根据支架材料和种子细胞的不同以及支架材料和种子细胞的不同组合，组织工程血管的构建有许多模型。但无论哪种构建模型，组织工程血管都应具备如下条件： 　　①具有或模拟体内血管壁三层结构，即：外膜，中膜和内膜； 　　②具有生物相容性，不易产生血栓，不易发生免疫排斥反应； 　　③具有生物学特性，如对药物刺激有舒缩反应； 　　④具有血管的力学特性。即有粘弹性并能承受一定的压力。关于种植细胞的种类，内皮细胞是使用最广泛，也是组织工程血管构建最必需的一种细胞，此外也种植平滑肌细胞和成纤维细胞，从而能构建典型的血管壁三层结构。关于细胞的来源，有同种异体细胞、异种细胞和宿主自体细胞。种植细胞的形式目前一般采用成体细胞。但目前认为采用经培养诱导干细胞而产生的血管壁细胞将是血管组织工程最理想的细胞来源，也是当前最具挑战性的研究工作。 　　组织工程血管的构建不仅是一项有意义的研究工作。还有很好的临床应用前景。本课题组设想在所取得的成果及经验的基础上，依托青岛大学医学院细胞培养实验室在干细胞研究方面的雄厚技术力量，跟上国外血管组织工程研究的最新方向，通过培养平滑肌细胞和成纤维细胞，以及分离外周血获得内皮祖细胞，体外定向分化，培养和扩增出血管内皮细胞，以此制备出组织工程血管，然后通过显微外科方法，并将制备的组织工程血管移植至供体猪，观察组织工程血管的生长和通畅性；内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞及ECM之间在体内或体外的相互影响。自体平滑肌细胞、成纤维细胞和外周血内皮祖细胞取材容易，扩增数量大，无免疫排斥及伦理道德问题等优点。这一研究的实施，将有助于在细胞及分子水平进行全生物化组织工程血管的构建研究。经文献检索，国内外尚未见密切相关报道。

　　任务来源： 　　青岛市科技发展计划。 　　随着医学的进步，外科技术的不断发展，许多复杂的先天性心脏病或大血管疾病都需要采用心外管道重建有效的血液循环。但迄今为止尚没有理想的血管替代材料。早期主要用合成材料（如涤纶等）替代血管进行治疗，但疗效不理想，常出现诸如栓塞，感染，钙化等许多并发症。更有甚者合成材料植入人体后不能生长，无法满足小儿生长发育要求，许多患者术后数年内需再次手术置换。 　　据流行病学调查结果，我国先心病的发病率为7～8‰，随着先心外科技术的发展，越来越多的复杂先心病可以通过手术纠治，而目前的状况是，很多患儿因无合适的心外管道而失去了手术纠治的机会；即使部分患儿有幸获得了手术治疗，其中相当一部分患者又因管道不能适应生长需要或钙化、阻塞等原因需再次甚至多次手术，极大地增加了手术危险性，加重了患儿痛苦及家庭、社会负担。因此如何解决血管替代物诸多缺陷，是一项非常迫切的科研任务。 　　本课题组设想在我们前期研究所取得的成果及经验的基础上，依托青岛大学医学院细胞培养实验室在干细胞研究方面的雄厚技术力量，跟上国外血管组织工程研究的最新方向，通过培养平滑肌细胞和成纤维细胞，以及分离外周血获得内皮祖细胞，体外定向分化，培养和扩增出血管内皮细胞，以此制备出组织工程血管，然后通过显微外科方法，并将制备的组织工程血管移植至供体猪，观察组织工程血管的生长和通畅性；内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞及ECM之间在体内或体外的相互影响。自体平滑肌细胞、成纤维细胞和外周血内皮祖细胞取材容易，扩增数量大，无免疫排斥及伦理道德问题等优点。这一研究的实施，有助于在细胞及分子水平进行全生物化组织工程血管的构建研究。 　　1.外周血中富含内皮祖细胞组分的分离：按照密度梯度离心法，用淋巴细胞分离液分离得到。 　　2.内皮祖细胞的体外培养和扩增：利用IMDM培养液，改变血清、VEGF、bFGF的浓度，来扩增EPC。 　　3.EPC的鉴定：采用DiU-acLDL 和lectin-UEA-1双标记来鉴定。 　　4.平滑肌细胞的分离、培养、鉴定：组织块培养方法，利用DMDM培养液，检测a-肌动蛋白、透射电镜检测。 　　5.血管脱细胞组织基质的制备：0.125﹪胰酶消化颈总动脉5cm。 　　6.培养得到组织工程血管。 　　7.血管移植。 　　8.术后进行Doppler超声检查观察血管通畅情况，并在第15天、30天 、60天随机取血管进行组织学观察。并对移植物进行功能分析。 　　近年来，组织工程(Tissue Engineering)技术的发展为解决这一问题提供了新的思路。组织工程血管是一种用组织工程学的方法构建的具有良好的生物相容性和力学特性的血管替代物。人造血管的发明及其内表面的改性处理为组织工程血管的研究奠定了坚实的基础。组织工程血管的基本构件是血管支架和种子细胞，根据支架材料和种子细胞的不同以及支架材料和种子细胞的不同组合，组织工程血管的构建有许多模型。但无论哪种构建模型，组织工程血管都应具备如下条件： 　　①具有或模拟体内血管壁三层结构，即：外膜，中膜和内膜； 　　②具有生物相容性，不易产生血栓，不易发生免疫排斥反应； 　　③具有生物学特性，如对药物刺激有舒缩反应； 　　④具有血管的力学特性。即有粘弹性并能承受一定的压力。关于种植细胞的种类，内皮细胞是使用最广泛，也是组织工程血管构建最必需的一种细胞，此外也种植平滑肌细胞和成纤维细胞，从而能构建典型的血管壁三层结构。关于细胞的来源，有同种异体细胞、异种细胞和宿主自体细胞。种植细胞的形式目前一般采用成体细胞。但目前认为采用经培养诱导干细胞而产生的血管壁细胞将是血管组织工程最理想的细胞来源，也是当前最具挑战性的研究工作。 　　组织工程血管的构建不仅是一项有意义的研究工作。还有很好的临床应用前景。本课题组设想在所取得的成果及经验的基础上，依托青岛大学医学院细胞培养实验室在干细胞研究方面的雄厚技术力量，跟上国外血管组织工程研究的最新方向，通过培养平滑肌细胞和成纤维细胞，以及分离外周血获得内皮祖细胞，体外定向分化，培养和扩增出血管内皮细胞，以此制备出组织工程血管，然后通过显微外科方法，并将制备的组织工程血管移植至供体猪，观察组织工程血管的生长和通畅性；内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞及ECM之间在体内或体外的相互影响。自体平滑肌细胞、成纤维细胞和外周血内皮祖细胞取材容易，扩增数量大，无免疫排斥及伦理道德问题等优点。这一研究的实施，将有助于在细胞及分子水平进行全生物化组织工程血管的构建研究。经文献检索，国内外尚未见密切相关报道。