人巨细胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）感染是我国儿科常见病种，可引起患儿多系统多损害，如肝炎、肺炎、脑炎、新生儿黄疸、发热、肝脾肿大、听力或视力损伤、发育迟缓、运动失调等。早产儿等免疫功能发育尚未完善者可引起严重甚至致死性感染。宫内感染可导致胎儿畸形及脑损害。因而，早期、快速诊断HCMV感染活动状态对患儿的及时治疗和预后至关重要。目前临床诊断HCMV感染主要依赖辅助检查，最常用的辅助检查手段为ELISA方法检测血清中特异性抗体。 　　目前国内市场流通的HCMV抗体检测试剂已经从间接法过渡至捕获法。虽然从理论上捕获法特异性和敏感性高于间接法，但是捕获法对试剂的要求更高，因此，国产HCMV抗体检测试剂从质量上并没有发生大的变化。而进口试剂虽然敏感、特异，但价格昂贵，因此，研发敏感、特异、成本低廉的HCMV抗体检测试剂，是临床所盼。 　　本课题组在成功重组表达HCMVgp52－pp65－pp150融合抗原和稳定的ELISA技术平台的基础上，系统研究了以融合蛋白作为标记抗原组装捕获法试剂盒的有关参数。并对其敏感性、特异性、精密度、稳定性等进行质量鉴定，进而完善了试剂盒的检测流程。研究结果表明： 　　1.根据HCMV标准株AD 169 gp52、pp150和pp65基因的核苷酸序列设计引物，PCR扩增克隆了gp52、pp150和pp65基因片段，核苷酸序列分析证实了其正确性；构建了相应的重组质粒 。 　　2.实现了gp52、pp150和pp65基因片段在大肠杆菌的融合表达，表达产物主要以可溶性形式存在。可溶性表达蛋白经GST亲和层析柱纯化后，采用ELISA和免疫印迹证实了重组蛋白的良好抗原性，而且GST载体蛋白的存在不影响其抗原性。 　　3.试剂盒的组装 　　扩增工程菌获得纯化抗原HCMVgp52－pp65－pp150，分别用三种方法对抗原进行辣根过氧化物酶标记，优选标记方法并滴定标记抗原的工作浓度，然后以此为试剂，组建捕获ELISA-抗体检测试剂盒，并对ELISA组装程序进行优化，确定反应条件和检测步骤。 　　4.利用纯化后的表达产物作为抗原，建立了ELISA方法。检测正常人及HCMV感染患者的血清标本，与进口试剂盒对比，本研究建立的ELISA-抗体检测试剂盒，试剂盒的灵敏度为93.8%；特异度为96.3%；粗一致性为96.1%；约登指数为0.901；批内变异系数为12.4%；稳定性良好，37℃保存试剂与4℃保存试剂进行对照试验，变异系数为13%。 　　数据表明，本课题研发的诊断试剂特异性强、敏感性高的特性，优于普通国产试剂，有推广价值。

　　人巨细胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）感染是我国儿科常见病种，可引起患儿多系统多损害，如肝炎、肺炎、脑炎、新生儿黄疸、发热、肝脾肿大、听力或视力损伤、发育迟缓、运动失调等。早产儿等免疫功能发育尚未完善者可引起严重甚至致死性感染。宫内感染可导致胎儿畸形及脑损害。因而，早期、快速诊断HCMV感染活动状态对患儿的及时治疗和预后至关重要。目前临床诊断HCMV感染主要依赖辅助检查，最常用的辅助检查手段为ELISA方法检测血清中特异性抗体。 　　目前国内市场流通的HCMV抗体检测试剂已经从间接法过渡至捕获法。虽然从理论上捕获法特异性和敏感性高于间接法，但是捕获法对试剂的要求更高，因此，国产HCMV抗体检测试剂从质量上并没有发生大的变化。而进口试剂虽然敏感、特异，但价格昂贵，因此，研发敏感、特异、成本低廉的HCMV抗体检测试剂，是临床所盼。 　　本课题组在成功重组表达HCMVgp52－pp65－pp150融合抗原和稳定的ELISA技术平台的基础上，系统研究了以融合蛋白作为标记抗原组装捕获法试剂盒的有关参数。并对其敏感性、特异性、精密度、稳定性等进行质量鉴定，进而完善了试剂盒的检测流程。研究结果表明： 　　1.根据HCMV标准株AD 169 gp52、pp150和pp65基因的核苷酸序列设计引物，PCR扩增克隆了gp52、pp150和pp65基因片段，核苷酸序列分析证实了其正确性；构建了相应的重组质粒 。 　　2.实现了gp52、pp150和pp65基因片段在大肠杆菌的融合表达，表达产物主要以可溶性形式存在。可溶性表达蛋白经GST亲和层析柱纯化后，采用ELISA和免疫印迹证实了重组蛋白的良好抗原性，而且GST载体蛋白的存在不影响其抗原性。 　　3.试剂盒的组装 　　扩增工程菌获得纯化抗原HCMVgp52－pp65－pp150，分别用三种方法对抗原进行辣根过氧化物酶标记，优选标记方法并滴定标记抗原的工作浓度，然后以此为试剂，组建捕获ELISA-抗体检测试剂盒，并对ELISA组装程序进行优化，确定反应条件和检测步骤。 　　4.利用纯化后的表达产物作为抗原，建立了ELISA方法。检测正常人及HCMV感染患者的血清标本，与进口试剂盒对比，本研究建立的ELISA-抗体检测试剂盒，试剂盒的灵敏度为93.8%；特异度为96.3%；粗一致性为96.1%；约登指数为0.901；批内变异系数为12.4%；稳定性良好，37℃保存试剂与4℃保存试剂进行对照试验，变异系数为13%。 　　数据表明，本课题研发的诊断试剂特异性强、敏感性高的特性，优于普通国产试剂，有推广价值。