本课题为山东省自然科学基金项目（编号：Y2006C02）。 　　人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs）具有支持造血和多向分化潜能，在机体组织的自我更新、组织修复等方面具有重要的生物学意义。其低免疫原性和负性免疫调控作用在组织工程和临床移植排斥反应的治疗中具有广阔的应用前景。然而随着年龄的增长，骨髓中间充质干细胞的数量急剧下降，使其研究和应用受到限制。资料表明，胎盘组织中含有丰富的MSCs，作为间充质干细胞的来源具有取材方便、无痛苦、不受伦理限制等优点。且人胎盘源间充质干细胞（Human placenta-derived mesenchymal stem cells，HPMSCs）同HBMSCs一样对T细胞增殖具有抑制作用。目前对HBMSCs和HPMSCs对T细胞增殖抑制作用机制尚不明确。众所周之，T细胞在移植排斥反应的发生中起着重要的作用，诱导受者T细胞对移植物产生耐受，为彻底克服器官移植排斥反应的理想措施。HBMSCs与生物材料相结合应用于医学生物工程领域也是目前对HBMSCs研究的一大热点。再生柞蚕丝素蛋白是我国特有的一种新型生物材料，除具有与家蚕丝素蛋白相似的化学组成外，柞蚕丝素蛋白具有有利于细胞黏附的RGD 序列。本研究首先以共刺激分子为切入点对HBMSCs和HPMSCs对T细胞增殖、活化调节作用机制及在造血重建中的作用进行了探讨，为HBMSCs和HPMSCs在临床移植排斥反应治疗中的应用和生物工程领域中的应用提供理论依据。 　　本课题取正常人的骨髓标本和胎盘标本分别以密度梯度离心和消化法分离HBMSCs和HPMSCs培养三代后用于实验。Ficoll密度梯度离心法常规分离人外周血中的PBMC经E花环法纯化T细胞。应用3H-TdR法、FCM、ELISA、共聚焦显微镜、电镜和光镜等技术，以共刺激分子B7H4和PDL1为切入点对HBMSCs和HPMSCs介导的T细胞活化和增殖抑制作用及可能机制，两者对脐血造血干细胞体外扩增的支持作用及柞蚕丝素蛋白对HBMSCs免疫调节作用的影响进行了研究。 　　结果表明，1、HBMSCs对PHA和PBMC作用下的T细胞增殖均有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。HBMSCs可明显抑制PHA活化的T细胞上CD25、CD69的表达，且该抑制作用在CD4+和CD8+T细胞亚群上具有相似的抑制效应；能够下调活化T细胞对IL-2和INF-γ的分泌，上调IL-10的分泌；使活化的T细胞滞留于G0/G1期，减少S期细胞的数量，使细胞周期发生改变。 　　2、HPMSCs体外对T细胞也具有明显的抑制作用，可使PHA刺激下的T细胞滞留于细胞周期的G0/G1期，下调活化T细胞早期表型CD25、CD69的表达，抑制IL-2、IFN-γ的分泌，从而对T细胞的活化增殖起到抑制作用。此外HPMSCs也可介导活化T细胞上调对IL-10的分泌，对活化T细胞起到抑制作用。即HPMSCs与HBMSCs对T细胞的负性调控作用相似，提示胎盘可作为间充质干细胞的良好来源。 　　3、HBMSCs表面不表达CD80，CD86，HLA-DR，PDL1，CD40，CD40L和FASL等与T细胞活化有关的免疫共刺激分子，但高表达负性免疫共刺激分子B7H4。阻断B7H4分子HBMSCs对T细胞增殖的抑制作用明显减弱，可下调T细胞周期中G0/G1期细胞数量，上调S期细胞数量，减弱HBMSCs对T细胞周期的影响。共聚焦显微镜分析结果表明，HBMSCs可抑制T细胞活化中NF-κB的核转位，阻断B7H4后这种抑制作用明显减弱。Transwell细胞培养系统分析结果显示，将HBMSCs与T细胞进行物理分隔后HBMSCs对T细胞增殖和活化的抑制作用均明显减弱，与直接接触组相比具有显著性意义。 　　4、流式细胞术检测结果显示，与HBMSCs相似，HPMSCs不表达CD80、CD86、CD40、CD40L、HLA-DR 、B7H4和FASL等与T细胞活化、增殖有关的细胞表面共刺激分子，但高表达PDL1分子。在PDL1mAb的阻断作用下， HPMSCs对T细胞增殖的抑制作用明显减弱，与有HPMSCs存在但无单抗组相比有显著性差异（p<0.01）；但与无HPMSCs存在只有PHA作用组相比仍然具有显著性差异（p<0.01）。从而证明了PDL1分子在HPMSCs介导的T细胞增殖抑制中发挥重要作用，为进一步研究HPMSCs的免疫调节作用奠定了基础。 　　5、体外扩增脐血造血干细胞的结果表明，（1）两种间充质干细胞的培养上清中均能检测到SCF、IL-6和 TNF-α，HPMSCs对IL-6和TNF-α的分泌均高于HBMSCs，但无统计学意义。（2） HPMSCs与HBMSCs一样体外能够有效地扩增CD34+脐血造血干细胞，能够维持造血干细胞扩增后黏附分子的表达，且二者之间无显著性差异；（3） HPMSCs和HBMSCs均能有效地趋化CD34+造血干/祖细胞，与对照组相比具有显著性差异，但两种间充质干细胞对CD34+造血干/祖细胞的趋化效果相似，无统计学意义。以上结果表明，HPMSCs可作为间充质干细胞的良好来源替代HBMSCs，可在体外有效扩增HSPCs，不仅能够提高HSPCs扩增的数量和质量，而且在HSPCs归巢和抑制免疫排斥方面的作用将有利于提高移植的成功率。 　　6、对柞蚕丝素蛋白对HBMSCs的生长、黏附和免疫调节作用影响的研究结果显示，（1）HBMSCs能够在柞蚕丝素蛋白上很好地黏附、生长。（2）柞蚕丝素蛋白对HBMSCs表面抗原CD44、CD34、CD45、 CD105、CD80、CD86、HLA-DR的表达无明显的影响，不改变HBMSCs对细胞因子的分泌。（3）柞蚕丝素蛋白单独不能激发T细胞活化、增殖，但能够维持HBMSCs对T细胞增殖、细胞因子分泌抑制作用的特性。以上结果支持HBMSCs联合再生柞蚕丝素应用于生物医学工程领域，同时也证明了再生柞蚕丝素蛋白是一种极具开发潜力的新型生物材料。 　　本研究的创新性与先进性：1、首次报到了B7H4分子在人HBMSCs上的表达及其参与对T细胞增殖抑制作用的分子机制；并对HPMSCs表达的共刺激分子进行了检测，证明了PDL1分子在HPMSCs上高表达，且在其介导的T细胞抑制中发挥重要作用。证明了HPMSCs与HBMSCs一样可通过改变细胞周期、抑制早期活化表型的表达和细胞因子的分泌对T细胞的增殖起抑制作用。为进一步研究MSCs的免疫调节作用机制奠定了坚实的基础。 　　2、对HPMSCs和HBMSCs体外对脐血造血干细胞的扩增效果进行了综合比较分析，证明两者在脐血造血干细胞扩增、扩增前后黏附分子的表达、对CD34+细胞的趋化作用和细胞因子的分泌等方面无显著性差异。从而为研究HPMSCs支持造血的分子机制奠定了基础，也解决了因年龄的增加HBMSCs数量急剧下降给MSCs的研究和临床应用带来的瓶颈困难。 　　3、首次报道HBMSCs可以很好地在柞蚕丝素蛋白上黏附、生长并能维持其对T细胞的免疫调节作用。该部分研究为跨生命学科和材料学科的交叉研究，不仅为HBMSCs与柞蚕丝素蛋白相结合在生物工程领域中的应用开辟新领域，同时也为柞蚕丝素蛋白在生物工程领域中的应用提供了理论依据。 　　经山东省医药卫生科技信息研究所查新检索证明，国内外未见相同的研究报告。

　　本课题为山东省自然科学基金项目（编号：Y2006C02）。 　　人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs）具有支持造血和多向分化潜能，在机体组织的自我更新、组织修复等方面具有重要的生物学意义。其低免疫原性和负性免疫调控作用在组织工程和临床移植排斥反应的治疗中具有广阔的应用前景。然而随着年龄的增长，骨髓中间充质干细胞的数量急剧下降，使其研究和应用受到限制。资料表明，胎盘组织中含有丰富的MSCs，作为间充质干细胞的来源具有取材方便、无痛苦、不受伦理限制等优点。且人胎盘源间充质干细胞（Human placenta-derived mesenchymal stem cells，HPMSCs）同HBMSCs一样对T细胞增殖具有抑制作用。目前对HBMSCs和HPMSCs对T细胞增殖抑制作用机制尚不明确。众所周之，T细胞在移植排斥反应的发生中起着重要的作用，诱导受者T细胞对移植物产生耐受，为彻底克服器官移植排斥反应的理想措施。HBMSCs与生物材料相结合应用于医学生物工程领域也是目前对HBMSCs研究的一大热点。再生柞蚕丝素蛋白是我国特有的一种新型生物材料，除具有与家蚕丝素蛋白相似的化学组成外，柞蚕丝素蛋白具有有利于细胞黏附的RGD 序列。本研究首先以共刺激分子为切入点对HBMSCs和HPMSCs对T细胞增殖、活化调节作用机制及在造血重建中的作用进行了探讨，为HBMSCs和HPMSCs在临床移植排斥反应治疗中的应用和生物工程领域中的应用提供理论依据。 　　本课题取正常人的骨髓标本和胎盘标本分别以密度梯度离心和消化法分离HBMSCs和HPMSCs培养三代后用于实验。Ficoll密度梯度离心法常规分离人外周血中的PBMC经E花环法纯化T细胞。应用3H-TdR法、FCM、ELISA、共聚焦显微镜、电镜和光镜等技术，以共刺激分子B7H4和PDL1为切入点对HBMSCs和HPMSCs介导的T细胞活化和增殖抑制作用及可能机制，两者对脐血造血干细胞体外扩增的支持作用及柞蚕丝素蛋白对HBMSCs免疫调节作用的影响进行了研究。 　　结果表明，1、HBMSCs对PHA和PBMC作用下的T细胞增殖均有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。HBMSCs可明显抑制PHA活化的T细胞上CD25、CD69的表达，且该抑制作用在CD4+和CD8+T细胞亚群上具有相似的抑制效应；能够下调活化T细胞对IL-2和INF-γ的分泌，上调IL-10的分泌；使活化的T细胞滞留于G0/G1期，减少S期细胞的数量，使细胞周期发生改变。 　　2、HPMSCs体外对T细胞也具有明显的抑制作用，可使PHA刺激下的T细胞滞留于细胞周期的G0/G1期，下调活化T细胞早期表型CD25、CD69的表达，抑制IL-2、IFN-γ的分泌，从而对T细胞的活化增殖起到抑制作用。此外HPMSCs也可介导活化T细胞上调对IL-10的分泌，对活化T细胞起到抑制作用。即HPMSCs与HBMSCs对T细胞的负性调控作用相似，提示胎盘可作为间充质干细胞的良好来源。 　　3、HBMSCs表面不表达CD80，CD86，HLA-DR，PDL1，CD40，CD40L和FASL等与T细胞活化有关的免疫共刺激分子，但高表达负性免疫共刺激分子B7H4。阻断B7H4分子HBMSCs对T细胞增殖的抑制作用明显减弱，可下调T细胞周期中G0/G1期细胞数量，上调S期细胞数量，减弱HBMSCs对T细胞周期的影响。共聚焦显微镜分析结果表明，HBMSCs可抑制T细胞活化中NF-κB的核转位，阻断B7H4后这种抑制作用明显减弱。Transwell细胞培养系统分析结果显示，将HBMSCs与T细胞进行物理分隔后HBMSCs对T细胞增殖和活化的抑制作用均明显减弱，与直接接触组相比具有显著性意义。 　　4、流式细胞术检测结果显示，与HBMSCs相似，HPMSCs不表达CD80、CD86、CD40、CD40L、HLA-DR 、B7H4和FASL等与T细胞活化、增殖有关的细胞表面共刺激分子，但高表达PDL1分子。在PDL1mAb的阻断作用下， HPMSCs对T细胞增殖的抑制作用明显减弱，与有HPMSCs存在但无单抗组相比有显著性差异（p<0.01）；但与无HPMSCs存在只有PHA作用组相比仍然具有显著性差异（p<0.01）。从而证明了PDL1分子在HPMSCs介导的T细胞增殖抑制中发挥重要作用，为进一步研究HPMSCs的免疫调节作用奠定了基础。 　　5、体外扩增脐血造血干细胞的结果表明，（1）两种间充质干细胞的培养上清中均能检测到SCF、IL-6和 TNF-α，HPMSCs对IL-6和TNF-α的分泌均高于HBMSCs，但无统计学意义。（2） HPMSCs与HBMSCs一样体外能够有效地扩增CD34+脐血造血干细胞，能够维持造血干细胞扩增后黏附分子的表达，且二者之间无显著性差异；（3） HPMSCs和HBMSCs均能有效地趋化CD34+造血干/祖细胞，与对照组相比具有显著性差异，但两种间充质干细胞对CD34+造血干/祖细胞的趋化效果相似，无统计学意义。以上结果表明，HPMSCs可作为间充质干细胞的良好来源替代HBMSCs，可在体外有效扩增HSPCs，不仅能够提高HSPCs扩增的数量和质量，而且在HSPCs归巢和抑制免疫排斥方面的作用将有利于提高移植的成功率。 　　6、对柞蚕丝素蛋白对HBMSCs的生长、黏附和免疫调节作用影响的研究结果显示，（1）HBMSCs能够在柞蚕丝素蛋白上很好地黏附、生长。（2）柞蚕丝素蛋白对HBMSCs表面抗原CD44、CD34、CD45、 CD105、CD80、CD86、HLA-DR的表达无明显的影响，不改变HBMSCs对细胞因子的分泌。（3）柞蚕丝素蛋白单独不能激发T细胞活化、增殖，但能够维持HBMSCs对T细胞增殖、细胞因子分泌抑制作用的特性。以上结果支持HBMSCs联合再生柞蚕丝素应用于生物医学工程领域，同时也证明了再生柞蚕丝素蛋白是一种极具开发潜力的新型生物材料。 　　本研究的创新性与先进性：1、首次报到了B7H4分子在人HBMSCs上的表达及其参与对T细胞增殖抑制作用的分子机制；并对HPMSCs表达的共刺激分子进行了检测，证明了PDL1分子在HPMSCs上高表达，且在其介导的T细胞抑制中发挥重要作用。证明了HPMSCs与HBMSCs一样可通过改变细胞周期、抑制早期活化表型的表达和细胞因子的分泌对T细胞的增殖起抑制作用。为进一步研究MSCs的免疫调节作用机制奠定了坚实的基础。 　　2、对HPMSCs和HBMSCs体外对脐血造血干细胞的扩增效果进行了综合比较分析，证明两者在脐血造血干细胞扩增、扩增前后黏附分子的表达、对CD34+细胞的趋化作用和细胞因子的分泌等方面无显著性差异。从而为研究HPMSCs支持造血的分子机制奠定了基础，也解决了因年龄的增加HBMSCs数量急剧下降给MSCs的研究和临床应用带来的瓶颈困难。 　　3、首次报道HBMSCs可以很好地在柞蚕丝素蛋白上黏附、生长并能维持其对T细胞的免疫调节作用。该部分研究为跨生命学科和材料学科的交叉研究，不仅为HBMSCs与柞蚕丝素蛋白相结合在生物工程领域中的应用开辟新领域，同时也为柞蚕丝素蛋白在生物工程领域中的应用提供了理论依据。 　　经山东省医药卫生科技信息研究所查新检索证明，国内外未见相同的研究报告。