一 课题来源、背景： 　　2009年3月以来，墨西哥、美国等北美国家相继发生人感染甲型H1N1新型流感的重大疫情，引起各国领导和世界卫生组织高度关注，世界卫生组织宣布进入紧急事态，4月29日至6月11日警告级别从4级提升到最高级别的6级。本市从8月4日出现首例病人后疫情开始扩散至9月份出现第一个流行高峰，10月中旬起形成第二个流行高峰，12月份起出现危重病例。由于所有人群对甲型H1N1流感病毒均无免疫力，因此其流行范围之广、时间之长、感染人数之众、对本市人民危害之大，近期内难以估计。为疾病控制和临床诊治需要提高甲型H1N1流感病毒检测速度增加样本检测数量是本中心急需攻关的科技方向。甲型H1N1疫苗制备、病毒变异及耐药毒株等基础研究均需要甲型H1N1病毒毒株提供研究平台，提高甲型H1N1病毒分离阳性率支持甲型H1N1的基础研究对今后控制与治疗甲型H1N1流感具有深远的社会和经济效益。 　　二 技术原理及性能指标： 　　1、快速诊断甲型H1N1的引物、探针序列由世界卫生组织提供推荐，上海超世生物科技公司合成，有以下4个荧光RT-PCR项目组成：InfA（人甲型通用）、SWInfA（猪甲型通用）、SWH1（猪甲1型）、RnaseP（内质控）。 　　2、甲型H1N1特异性引物、探针-1，由浙江省疾控中心卢亦愚博士赠与。甲型H1N1特异性引物、探针-2，购自上海超世生物科技公司。 　　3、甲型H1N1病毒核酸提取试剂盒（17042）、荧光RT-PCR扩增试剂盒（DRR064A）分别购自德国QIAGEN公司和宝生物工程（大连）有限公司。 　　4、主要仪器设备：罗斯Light Cycler2.0荧光PCR仪、Thermo-A2生物安全柜、台式高速离心机等。 　　5、比对用标准毒株：国家流感中心下发的考核用盲样（编号：191-1、191-6、19-7）。 　　6、荧光RT-PCR的反应程序： 　　7、世界卫生组织提供推荐的荧光RT-PCR反应程序：42℃30分钟（逆转录）、95℃2分钟（灭活逆转录酶）一个循环，95℃15秒（变性）、55℃30秒（复性延伸）45个循环。理论时间66分钟，实际时间86～92分钟。 　　8、上海超世生物科技公司提供的荧光RT-PCR反应程序：50℃30分钟（逆转录）、95℃2分钟（灭活逆转录酶）一个循环，95℃10秒（变性）、58℃30秒（复性延伸）45个循环。理论时间62分钟，实际时间82～90分钟。 　　9、本中心优化后的快速荧光RT-PCR反应程序：42℃5分钟（逆转录）、95℃10秒（灭活逆转录酶）一个循环，95℃5秒（变性）、58℃35秒（复性延伸）45个循环。理论时间35分钟，实际时间45～50分钟。 　　三创造性与先进性： 　　1、本成果用于甲型H1N1流感病毒核酸检测速度比WHO推荐的方法快一倍，对流行病学调查或临床重症病人抢救具有较大现实意义； 　　2、本成果用于甲型H1N1流感病毒核酸检测时的引物兼容性与曲线形态均好于WHO推荐的方法； 　　3、本成果用于甲型H1N1流感病毒核酸检测的敏感度、特异度、重复性均与WHO推荐的方法一致。 　　四 技术成熟度、安全性、适应范围 　　本技术已检测了700份甲型H1N1样本效果明显，经过6个月左右时间的应用比对已基本成熟、安全性能与WHO推荐的方法一致、适应范围广泛除检测甲型H1N1外还可用于其它各型流感病毒。

　　一 课题来源、背景： 　　2009年3月以来，墨西哥、美国等北美国家相继发生人感染甲型H1N1新型流感的重大疫情，引起各国领导和世界卫生组织高度关注，世界卫生组织宣布进入紧急事态，4月29日至6月11日警告级别从4级提升到最高级别的6级。本市从8月4日出现首例病人后疫情开始扩散至9月份出现第一个流行高峰，10月中旬起形成第二个流行高峰，12月份起出现危重病例。由于所有人群对甲型H1N1流感病毒均无免疫力，因此其流行范围之广、时间之长、感染人数之众、对本市人民危害之大，近期内难以估计。为疾病控制和临床诊治需要提高甲型H1N1流感病毒检测速度增加样本检测数量是本中心急需攻关的科技方向。甲型H1N1疫苗制备、病毒变异及耐药毒株等基础研究均需要甲型H1N1病毒毒株提供研究平台，提高甲型H1N1病毒分离阳性率支持甲型H1N1的基础研究对今后控制与治疗甲型H1N1流感具有深远的社会和经济效益。 　　二 技术原理及性能指标： 　　1、快速诊断甲型H1N1的引物、探针序列由世界卫生组织提供推荐，上海超世生物科技公司合成，有以下4个荧光RT-PCR项目组成：InfA（人甲型通用）、SWInfA（猪甲型通用）、SWH1（猪甲1型）、RnaseP（内质控）。 　　2、甲型H1N1特异性引物、探针-1，由浙江省疾控中心卢亦愚博士赠与。甲型H1N1特异性引物、探针-2，购自上海超世生物科技公司。 　　3、甲型H1N1病毒核酸提取试剂盒（17042）、荧光RT-PCR扩增试剂盒（DRR064A）分别购自德国QIAGEN公司和宝生物工程（大连）有限公司。 　　4、主要仪器设备：罗斯Light Cycler2.0荧光PCR仪、Thermo-A2生物安全柜、台式高速离心机等。 　　5、比对用标准毒株：国家流感中心下发的考核用盲样（编号：191-1、191-6、19-7）。 　　6、荧光RT-PCR的反应程序： 　　7、世界卫生组织提供推荐的荧光RT-PCR反应程序：42℃30分钟（逆转录）、95℃2分钟（灭活逆转录酶）一个循环，95℃15秒（变性）、55℃30秒（复性延伸）45个循环。理论时间66分钟，实际时间86～92分钟。 　　8、上海超世生物科技公司提供的荧光RT-PCR反应程序：50℃30分钟（逆转录）、95℃2分钟（灭活逆转录酶）一个循环，95℃10秒（变性）、58℃30秒（复性延伸）45个循环。理论时间62分钟，实际时间82～90分钟。 　　9、本中心优化后的快速荧光RT-PCR反应程序：42℃5分钟（逆转录）、95℃10秒（灭活逆转录酶）一个循环，95℃5秒（变性）、58℃35秒（复性延伸）45个循环。理论时间35分钟，实际时间45～50分钟。 　　三创造性与先进性： 　　1、本成果用于甲型H1N1流感病毒核酸检测速度比WHO推荐的方法快一倍，对流行病学调查或临床重症病人抢救具有较大现实意义； 　　2、本成果用于甲型H1N1流感病毒核酸检测时的引物兼容性与曲线形态均好于WHO推荐的方法； 　　3、本成果用于甲型H1N1流感病毒核酸检测的敏感度、特异度、重复性均与WHO推荐的方法一致。 　　四 技术成熟度、安全性、适应范围 　　本技术已检测了700份甲型H1N1样本效果明显，经过6个月左右时间的应用比对已基本成熟、安全性能与WHO推荐的方法一致、适应范围广泛除检测甲型H1N1外还可用于其它各型流感病毒。