技术方案分为3部分： （一）广州地区细菌耐药性资源库的创建 本数据库信息主要包括细菌药敏资源库和耐药菌的临床信息资源库。药敏信息库有三个方面：收集各医院提供所有细菌的药敏数据，共同导入WHONET5.4软件分析，了解整个地区耐药菌分布和耐药趋势；采用统一方法（纸片法）和试验药物对各医院连续3个月收集的8种重要耐药菌进行药敏检测，得到准确可靠的药敏数据；运用WHONET软件分析多重耐药株(MDR)和泛耐药株(PDR)的月分离率，并结合分子流行病学方法预测院内感染爆发流行。 临床信息库是立足于特殊耐药菌的临床背景，设计调查表格进行回顾性分析。其内容包括10个板块，如感染部位，有创性操作或手术史，抗生素或皮质激素使用史，患者接受针对目标菌治疗后的疗效转归等。临床信息可以帮助医生分析细菌感染的危险因素，判断痰标本来源菌是属于感染或定植，评估抗生素在体内的疗效。 通过10年的努力，广州地区细菌耐药性监测资源平台已初建规模，16家医院报送细菌药敏信息达20000株左右，收集有重要科研价值菌株3000多株，完成特殊耐药菌临床信息表1000余份，发放耐药监测小册子2万余份，培训医技人员3000余人次，并建立了自己的专业网站（www.gsoar.com，www.gsoar.org，目前网站ICP注册还在备案中，使用临时域名：http://hgc35154.chinaw3.com/default.aspx），不仅实现了网上数据交流平台，而且也使细菌耐药信息服务于大众。 （二）在资源平台基础上进行创新研究 在建立了细菌耐药数据平台同时，有必要再建立进行细菌耐药机制研究的基础技术平台，以服务于临床和科研。为此，我们建立了药敏试验组、分子流行病学组，基因组学研究组和蛋白质分析组等4个实验平台，并储备了一些特殊耐药性的工程菌（如IMP-1～IMP-10、多种ESBL表型），为本监测网点医院和友邻单位提供科研服务。下面就所完成的基础研究工作总结如下，分为四部分： 第一部分：广州地区超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的研究 肠杆菌科细菌产ESBLs是细菌对三代头孢菌素耐药的主要原因。为此本项目自2000年起，就开展对本地区ESBLs表型进行研究。发现了本地区ESBL表型谱的动态变迁，并检测到部分新型的耐药基因表型。 1.ESBL第一阶段的表型特征；早在2000年，本项目骨干熊剑辉和肖庆忠（现均留学国外）就对本地区的ESBLs表型进行了大量分析，全球第一个CTX-M-14，CTX-M-9和CTX-M-13就在本地区发现。（GeneBank登陆号：AF462398，AF252621，AF252623）。在2000～2003年通过对本地区4000余株G-杆菌分析，发现该阶段ESBLs表型主要为CTX-M-9和CTX-M-24，其次为SHV-12/5a。其余表型为CTX-M-3、CTX-M-14、CTX-M-22、TOHO-2、TOHO-3和OXA-10与PSE-2。 2.ESBL第二阶段的表型特征；自2007年起，本项目再次对广州地区10家医院临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌所产ESBLs表型进行调查，发现ESBL表型谱较前一阶段有明显变化。67.3%的ESBLs产生株为CTX-M表型，其中CTX-M-1群和CTX-M-9群各占46.9%和53.1%，未发现其他CTX-M亚群。CTX-M-14和CTXM-15是最常见的ESBLs分子表型。 本阶段最有价值的发现是：检测到以CTX-M-15为代表的一组对头孢他定有水解活性的新CTX-M酶，如CTX-M-55，CTX-M-57，CTX-M-19，CTX-M-27。特别是CTX-M-15，是国内首家对其高发生情况进行系列分析的报道。而且发现了CTX-M-15有别于国外的新传播规律：本地区blaCTX-M-15多位于大肠埃希菌65kb和肺炎克雷伯菌92kb可接合质粒上，65kb质粒的大小和基因结构与国外流行质粒都不相同，而92kb质粒类似于流行质粒pc15-1a，但国外该流行质粒仅见于大肠埃希菌，而本成果主要见于肺炎克雷伯菌。 第二部分：广州地区碳氢霉烯水解酶的研究 碳氢霉烯水解酶包括属ESBL类的碳氢霉烯水解酶（如KPC、OXA酶）和金属β内酰胺酶，其共同特点是都能水解碳氢霉烯药物，导致细菌泛耐药。世界各地因为用药习惯、菌株来源等因素，其发生情况都不尽一致，如欧洲以KPC、OXA为主，而日本以IMP型金属酶为主。研究碳氢霉烯水解酶不仅有利于明确本地区控制泛耐药菌株的出现，而且为临床针对性选用抗菌药物提供依据。在本课题开始之前，该方向研究一直处于空白。 在10年的连续研究中，我们对本地区的碳氢霉烯水解酶进行了系统调查，发现广州地区碳氢霉烯水解酶主要以IMP型金属酶为主，而KPC-2酶极少见，OXA-23酶的发生率也极低。该结论也解释了广州地区泛耐药铜绿假单胞菌多，而泛耐药鲍曼不动杆菌比例少的原因。更重要的是，发现了两个具有广州特色的金属β内酰胺酶新基因：IMP-9和IMP-25.两者都是在全球首先发现。以IMP-9为例，对blaIMP-9基因环境分析，blaIMP-9位于约3.5kb可移动的基因元件I型整合子上，而且在该整合子上还有其他三个耐药基因aacA4、blaOXA-10及aadA2（基因登陆号：FJ655384，EU176818）。这不仅造成该菌对多种抗菌药物耐药，而且耐药基因可随着质粒和整合子的传播，使耐药菌范围扩大，甚至形成爆发流行。该结论在2005年3至2007年3月对本地区泛耐药铜绿假单胞菌株的分子流行病学调查中得到了证实。分析4家医院134株铜绿假单胞菌泛耐药株(PDR)的同源性，发现4家医院存在产IMP-9铜绿假单胞菌的爆发流行，其中主要流行型A型有45株，主要在医院A的中心ICU传播流行。其余3家医院也存在各自的流行株，分别为：B、C、D医院的流行株B型、C型、D型，分别占各医院的总分离株数的22.6%(7/31)、33.3%(6/18)、31.6%(6/19)。克隆株Q型同时存在于B医院与D医院，B医院和C医院分别有1株菌与A医院的A型同源性在80%以上。我们将这个信息反馈给相关医院的感控部门，采取消毒隔离和规范用药等控制措施，使该流行株得到控制。2007～2009年再次调查，IMP-9在PDR株的发生率已由97.7%降为11.7%，而本地区PDR发生率也由2005的26%降为2008年的1.5%。 与铜绿假单胞菌产生的获得性金属酶IMP-9不同，嗜麦芽窄食单胞菌产生金属β-内酰胺酶（L1酶），是对亚胺培南耐药的主要原因。但有关金属酶的调控机制至今未明确，国外报道可能与16S rRNA基因型、质粒参与介导有关。本成果以16S rRNA基因型突变点分析、gene waliking分析blaL1启动子区域、蛋白组学分析耐药相关的双组分系统等实验，对金属酶的调控机制进行了初步分析，推测嗜麦芽窄食单胞菌所产金属酶的表达差异是多因素作用的结果。其中菌株16S rRNA基因型有一定关系（表），但与国外所报道的“金属酶表达与16S rRNA基因型对应关系”结论不一致。而且也否认了国外“嗜麦芽窄食单胞菌存在质粒介导金属酶”的假说。 第三部分：细菌耐药性获得对毒力的影响 铜绿假单胞菌是呼吸系统是最常分离的病原菌，但细菌在痰标本的意义一直存在争议，尤其是院内感染者。临床很难仅从标本判断出感染还是定植。本成果利用铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统(TTSS)为研究对象，用基因和蛋白组学方法，开创性地研究了“非发酵菌耐药性获得对细菌毒力的影响”。研究分为两个部分：一、调查Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)的毒力基因exoU、exoS在铜绿假单胞菌临床分离株的分布情况，了解exoU阳性株和exoS阳性株对抗菌药物耐药性的差异。二、筛选患者痰中存在药敏由敏感向泛耐演化的同一克隆株，蛋白组学分析不同耐药谱克隆株相关毒力蛋白的表达差异，并和患者的临床转归进行比对。调查显示，来自5家医院临床分离的铜绿假单胞菌189株，通过PCR试验检测，161株携带TTSS系统，其中120株exoS阳性，31株exoU阳性，3株exoU和exoS双阳性，7株exoU和exoS双阴性。剩余28株为TTSS阴性。痰标本和血标本都以exo S+/exoU-表型最常见，分别占TTSS 阳性株的72%和81.5%。药敏分析，TTSS阴性菌株对头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、阿米卡星、环丙沙星的敏感性都较TTSS阳性菌株低。Exo U+/exo S-株（细胞毒型）和exo S+/exo U-株（侵袭型）的药敏相比，对所有药物的敏感性都无统计学差异。该结果提示，Ⅲ型分泌系统存在于大多铜绿假单胞菌临床株中，本地区铜绿假单胞菌的毒力基因型以exoU-/exoS+常见，在痰和血标本中也以exoU-/exoS+比例高。细菌的药敏谱不能作为区分细胞毒型和侵袭型铜绿假单胞菌的依据。由于在标本分布和药敏谱方面，强毒力的exo U+/exo S-株（细胞毒型）与exo S+/exo U-株（侵袭型）未发现差异，第二部分实验则从蛋白表达水平了解相关毒力因子是否随药敏谱变化而改变。本研究从不同三个住院时期的一个COPD合并HAP患者痰中获得了鉴定为exo U+/exo S-型（细胞毒型）的铜绿假单胞菌，分子流行病学分析属同一克隆株。3次药敏谱依次为：敏感—多重耐药(MDR)—泛耐药，分别命名为S-PA，MDR-PA和PDR-PA。取3株菌全菌蛋白作二维凝胶电泳，分析差异蛋白点，推测蛋白功能性质。经蛋白质谱分析和genebank比对，在17个差异蛋白点中检到与TTSS相关的毒力蛋白DsbA（二硫键形成蛋白A），该蛋白在S-PA表达最低，PDR-PA表达最高。由于DsbA是TTSS基因表达的所需蛋白，因此推测，DsbA的高表达可能会促成TTSS相关效应蛋白表达上调，使菌株毒力增加。而对该患者的病历复习，也显示患者在最后一次（PDR分离时）肺部感染最重。由此得到结论：exo U+/exo S-型铜绿假单胞菌在长期寄植于呼吸道过程中，其耐药性和毒力都得到增强。该发现为解决“区分下呼吸道来源非发酵菌感染/定植”的临床难题提供了重要的实验依据。 应用推广： 1.指导本省多家医院降低多重耐药菌发生率，制导临床学科合理使用抗生素，节省医疗成本，减少医患纠纷。 2.为临床诊断细菌感染提供帮助。 3.指导医院感染控制部门降低院内感染发生率。 4.在实践中提高临床微生物室的检测水平。 5.为相关领域的科研人员提供方法学指导。

技术方案分为3部分： （一）广州地区细菌耐药性资源库的创建 本数据库信息主要包括细菌药敏资源库和耐药菌的临床信息资源库。药敏信息库有三个方面：收集各医院提供所有细菌的药敏数据，共同导入WHONET5.4软件分析，了解整个地区耐药菌分布和耐药趋势；采用统一方法（纸片法）和试验药物对各医院连续3个月收集的8种重要耐药菌进行药敏检测，得到准确可靠的药敏数据；运用WHONET软件分析多重耐药株(MDR)和泛耐药株(PDR)的月分离率，并结合分子流行病学方法预测院内感染爆发流行。 临床信息库是立足于特殊耐药菌的临床背景，设计调查表格进行回顾性分析。其内容包括10个板块，如感染部位，有创性操作或手术史，抗生素或皮质激素使用史，患者接受针对目标菌治疗后的疗效转归等。临床信息可以帮助医生分析细菌感染的危险因素，判断痰标本来源菌是属于感染或定植，评估抗生素在体内的疗效。 通过10年的努力，广州地区细菌耐药性监测资源平台已初建规模，16家医院报送细菌药敏信息达20000株左右，收集有重要科研价值菌株3000多株，完成特殊耐药菌临床信息表1000余份，发放耐药监测小册子2万余份，培训医技人员3000余人次，并建立了自己的专业网站（www.gsoar.com，www.gsoar.org，目前网站ICP注册还在备案中，使用临时域名：http://hgc35154.chinaw3.com/default.aspx），不仅实现了网上数据交流平台，而且也使细菌耐药信息服务于大众。 （二）在资源平台基础上进行创新研究 在建立了细菌耐药数据平台同时，有必要再建立进行细菌耐药机制研究的基础技术平台，以服务于临床和科研。为此，我们建立了药敏试验组、分子流行病学组，基因组学研究组和蛋白质分析组等4个实验平台，并储备了一些特殊耐药性的工程菌（如IMP-1～IMP-10、多种ESBL表型），为本监测网点医院和友邻单位提供科研服务。下面就所完成的基础研究工作总结如下，分为四部分： 第一部分：广州地区超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的研究 肠杆菌科细菌产ESBLs是细菌对三代头孢菌素耐药的主要原因。为此本项目自2000年起，就开展对本地区ESBLs表型进行研究。发现了本地区ESBL表型谱的动态变迁，并检测到部分新型的耐药基因表型。 1.ESBL第一阶段的表型特征；早在2000年，本项目骨干熊剑辉和肖庆忠（现均留学国外）就对本地区的ESBLs表型进行了大量分析，全球第一个CTX-M-14，CTX-M-9和CTX-M-13就在本地区发现。（GeneBank登陆号：AF462398，AF252621，AF252623）。在2000～2003年通过对本地区4000余株G-杆菌分析，发现该阶段ESBLs表型主要为CTX-M-9和CTX-M-24，其次为SHV-12/5a。其余表型为CTX-M-3、CTX-M-14、CTX-M-22、TOHO-2、TOHO-3和OXA-10与PSE-2。 2.ESBL第二阶段的表型特征；自2007年起，本项目再次对广州地区10家医院临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌所产ESBLs表型进行调查，发现ESBL表型谱较前一阶段有明显变化。67.3%的ESBLs产生株为CTX-M表型，其中CTX-M-1群和CTX-M-9群各占46.9%和53.1%，未发现其他CTX-M亚群。CTX-M-14和CTXM-15是最常见的ESBLs分子表型。 本阶段最有价值的发现是：检测到以CTX-M-15为代表的一组对头孢他定有水解活性的新CTX-M酶，如CTX-M-55，CTX-M-57，CTX-M-19，CTX-M-27。特别是CTX-M-15，是国内首家对其高发生情况进行系列分析的报道。而且发现了CTX-M-15有别于国外的新传播规律：本地区blaCTX-M-15多位于大肠埃希菌65kb和肺炎克雷伯菌92kb可接合质粒上，65kb质粒的大小和基因结构与国外流行质粒都不相同，而92kb质粒类似于流行质粒pc15-1a，但国外该流行质粒仅见于大肠埃希菌，而本成果主要见于肺炎克雷伯菌。 第二部分：广州地区碳氢霉烯水解酶的研究 碳氢霉烯水解酶包括属ESBL类的碳氢霉烯水解酶（如KPC、OXA酶）和金属β内酰胺酶，其共同特点是都能水解碳氢霉烯药物，导致细菌泛耐药。世界各地因为用药习惯、菌株来源等因素，其发生情况都不尽一致，如欧洲以KPC、OXA为主，而日本以IMP型金属酶为主。研究碳氢霉烯水解酶不仅有利于明确本地区控制泛耐药菌株的出现，而且为临床针对性选用抗菌药物提供依据。在本课题开始之前，该方向研究一直处于空白。 在10年的连续研究中，我们对本地区的碳氢霉烯水解酶进行了系统调查，发现广州地区碳氢霉烯水解酶主要以IMP型金属酶为主，而KPC-2酶极少见，OXA-23酶的发生率也极低。该结论也解释了广州地区泛耐药铜绿假单胞菌多，而泛耐药鲍曼不动杆菌比例少的原因。更重要的是，发现了两个具有广州特色的金属β内酰胺酶新基因：IMP-9和IMP-25.两者都是在全球首先发现。以IMP-9为例，对blaIMP-9基因环境分析，blaIMP-9位于约3.5kb可移动的基因元件I型整合子上，而且在该整合子上还有其他三个耐药基因aacA4、blaOXA-10及aadA2（基因登陆号：FJ655384，EU176818）。这不仅造成该菌对多种抗菌药物耐药，而且耐药基因可随着质粒和整合子的传播，使耐药菌范围扩大，甚至形成爆发流行。该结论在2005年3至2007年3月对本地区泛耐药铜绿假单胞菌株的分子流行病学调查中得到了证实。分析4家医院134株铜绿假单胞菌泛耐药株(PDR)的同源性，发现4家医院存在产IMP-9铜绿假单胞菌的爆发流行，其中主要流行型A型有45株，主要在医院A的中心ICU传播流行。其余3家医院也存在各自的流行株，分别为：B、C、D医院的流行株B型、C型、D型，分别占各医院的总分离株数的22.6%(7/31)、33.3%(6/18)、31.6%(6/19)。克隆株Q型同时存在于B医院与D医院，B医院和C医院分别有1株菌与A医院的A型同源性在80%以上。我们将这个信息反馈给相关医院的感控部门，采取消毒隔离和规范用药等控制措施，使该流行株得到控制。2007～2009年再次调查，IMP-9在PDR株的发生率已由97.7%降为11.7%，而本地区PDR发生率也由2005的26%降为2008年的1.5%。 与铜绿假单胞菌产生的获得性金属酶IMP-9不同，嗜麦芽窄食单胞菌产生金属β-内酰胺酶（L1酶），是对亚胺培南耐药的主要原因。但有关金属酶的调控机制至今未明确，国外报道可能与16S rRNA基因型、质粒参与介导有关。本成果以16S rRNA基因型突变点分析、gene waliking分析blaL1启动子区域、蛋白组学分析耐药相关的双组分系统等实验，对金属酶的调控机制进行了初步分析，推测嗜麦芽窄食单胞菌所产金属酶的表达差异是多因素作用的结果。其中菌株16S rRNA基因型有一定关系（表），但与国外所报道的“金属酶表达与16S rRNA基因型对应关系”结论不一致。而且也否认了国外“嗜麦芽窄食单胞菌存在质粒介导金属酶”的假说。 第三部分：细菌耐药性获得对毒力的影响 铜绿假单胞菌是呼吸系统是最常分离的病原菌，但细菌在痰标本的意义一直存在争议，尤其是院内感染者。临床很难仅从标本判断出感染还是定植。本成果利用铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统(TTSS)为研究对象，用基因和蛋白组学方法，开创性地研究了“非发酵菌耐药性获得对细菌毒力的影响”。研究分为两个部分：一、调查Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)的毒力基因exoU、exoS在铜绿假单胞菌临床分离株的分布情况，了解exoU阳性株和exoS阳性株对抗菌药物耐药性的差异。二、筛选患者痰中存在药敏由敏感向泛耐演化的同一克隆株，蛋白组学分析不同耐药谱克隆株相关毒力蛋白的表达差异，并和患者的临床转归进行比对。调查显示，来自5家医院临床分离的铜绿假单胞菌189株，通过PCR试验检测，161株携带TTSS系统，其中120株exoS阳性，31株exoU阳性，3株exoU和exoS双阳性，7株exoU和exoS双阴性。剩余28株为TTSS阴性。痰标本和血标本都以exo S+/exoU-表型最常见，分别占TTSS 阳性株的72%和81.5%。药敏分析，TTSS阴性菌株对头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、阿米卡星、环丙沙星的敏感性都较TTSS阳性菌株低。Exo U+/exo S-株（细胞毒型）和exo S+/exo U-株（侵袭型）的药敏相比，对所有药物的敏感性都无统计学差异。该结果提示，Ⅲ型分泌系统存在于大多铜绿假单胞菌临床株中，本地区铜绿假单胞菌的毒力基因型以exoU-/exoS+常见，在痰和血标本中也以exoU-/exoS+比例高。细菌的药敏谱不能作为区分细胞毒型和侵袭型铜绿假单胞菌的依据。由于在标本分布和药敏谱方面，强毒力的exo U+/exo S-株（细胞毒型）与exo S+/exo U-株（侵袭型）未发现差异，第二部分实验则从蛋白表达水平了解相关毒力因子是否随药敏谱变化而改变。本研究从不同三个住院时期的一个COPD合并HAP患者痰中获得了鉴定为exo U+/exo S-型（细胞毒型）的铜绿假单胞菌，分子流行病学分析属同一克隆株。3次药敏谱依次为：敏感—多重耐药(MDR)—泛耐药，分别命名为S-PA，MDR-PA和PDR-PA。取3株菌全菌蛋白作二维凝胶电泳，分析差异蛋白点，推测蛋白功能性质。经蛋白质谱分析和genebank比对，在17个差异蛋白点中检到与TTSS相关的毒力蛋白DsbA（二硫键形成蛋白A），该蛋白在S-PA表达最低，PDR-PA表达最高。由于DsbA是TTSS基因表达的所需蛋白，因此推测，DsbA的高表达可能会促成TTSS相关效应蛋白表达上调，使菌株毒力增加。而对该患者的病历复习，也显示患者在最后一次（PDR分离时）肺部感染最重。由此得到结论：exo U+/exo S-型铜绿假单胞菌在长期寄植于呼吸道过程中，其耐药性和毒力都得到增强。该发现为解决“区分下呼吸道来源非发酵菌感染/定植”的临床难题提供了重要的实验依据。 应用推广： 1.指导本省多家医院降低多重耐药菌发生率，制导临床学科合理使用抗生素，节省医疗成本，减少医患纠纷。 2.为临床诊断细菌感染提供帮助。 3.指导医院感染控制部门降低院内感染发生率。 4.在实践中提高临床微生物室的检测水平。 5.为相关领域的科研人员提供方法学指导。