一、主要实验技术 　　1.纳米羟基磷灰石人工骨材料的合成 　　采用溶胶-絮凝法制备纳米羟基磷灰石（Nano-HA）粉体，采用不同工艺分别制成孔隙分布均匀，不同孔径的多孔Nano-HA 人工骨。 　　2.不同孔径的多孔纳米羟基磷灰石人工骨修复兔桡骨缺损的实验研究 　　制备兔的骨缺损动物模型，用三种不同孔径的多孔Nano-HA 人工骨材料进行骨缺损修复实验，选择孔径合适的Nano-HA 材料，使其具有最好的成骨效果和生物降解速率。 　　3.构建含人BMP-2 基因的重组腺病毒载体 　　用PCR 方法扩增BMP-2 目的基因，并插入载体pMD19-T Simple Vector 中进行测序分析。将BMP-2 基因亚克隆到穿梭载体pEC3.1(+)中，构建pEC3.1-BMP-2 穿梭质粒，再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iT-DEST 腺病毒载体中，线性化后转293 细胞进行包装，获得重组腺病毒rAd-BMP2。 　　4.骨髓间充质干细胞的培养和转染 　　采用密度梯度离心法联合贴壁法分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞，用重组腺病毒rAd-BMP2 转染细胞。 　　5.仿生人工骨的构建 　　采用负压抽吸法构建细胞支架载体复合物仿生人工骨。 　　6.制备兔桡骨骨缺损动物模型、活骨植入及异位成骨实验 　　在距桡骨近端2.5cm 处用线锯连同骨膜一起锯断桡骨，以同样的方法于第一截骨线远侧1.5cm 处再次锯断桡骨，连同骨膜切除两断端间的桡骨，按不同的组别分别植入材料。 　　7.手术后的指标观察 　　各组实验动物分别于术后2周、4周、8周、12周分别进行X 线测量、组织学及免疫组化检测、电镜分析、生物力学测定。 　　二、应用前景 　　骨折延期愈合、骨折不愈合及骨缺损的临床治疗甚为棘手，传统植骨无论是自体骨还是同种异体骨，也无论是生物骨还是人造骨，均无活性细胞，是没有生命力的死骨，需依赖于人体对植入“死骨”的改造 ，因此，成功率并不为临床满意。能否植入“活性骨”则是一个新的概念，也成为临床医生的梦想。 　　本课题采用腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因转染自体骨髓间充质干细胞，复合性状与自然骨接近但无疾病传染及来源限制之虑的纳米羟基磷灰石，制备成含有活种子细胞的组织工程化骨，观察新型组织工程化骨与其他人工骨成骨能力的差异，为新型组织工程化骨应用于临床提供实验依据。 　　本课题将为骨折不愈合及骨缺损的临床治疗提供一种全新的治疗方法，可有望广泛应用于骨折延期愈合、骨折不愈合及骨缺损的临床治疗，并解决困扰人类多年的骨替代物无活性的难题。

　　一、主要实验技术 　　1.纳米羟基磷灰石人工骨材料的合成 　　采用溶胶-絮凝法制备纳米羟基磷灰石（Nano-HA）粉体，采用不同工艺分别制成孔隙分布均匀，不同孔径的多孔Nano-HA 人工骨。 　　2.不同孔径的多孔纳米羟基磷灰石人工骨修复兔桡骨缺损的实验研究 　　制备兔的骨缺损动物模型，用三种不同孔径的多孔Nano-HA 人工骨材料进行骨缺损修复实验，选择孔径合适的Nano-HA 材料，使其具有最好的成骨效果和生物降解速率。 　　3.构建含人BMP-2 基因的重组腺病毒载体 　　用PCR 方法扩增BMP-2 目的基因，并插入载体pMD19-T Simple Vector 中进行测序分析。将BMP-2 基因亚克隆到穿梭载体pEC3.1(+)中，构建pEC3.1-BMP-2 穿梭质粒，再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iT-DEST 腺病毒载体中，线性化后转293 细胞进行包装，获得重组腺病毒rAd-BMP2。 　　4.骨髓间充质干细胞的培养和转染 　　采用密度梯度离心法联合贴壁法分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞，用重组腺病毒rAd-BMP2 转染细胞。 　　5.仿生人工骨的构建 　　采用负压抽吸法构建细胞支架载体复合物仿生人工骨。 　　6.制备兔桡骨骨缺损动物模型、活骨植入及异位成骨实验 　　在距桡骨近端2.5cm 处用线锯连同骨膜一起锯断桡骨，以同样的方法于第一截骨线远侧1.5cm 处再次锯断桡骨，连同骨膜切除两断端间的桡骨，按不同的组别分别植入材料。 　　7.手术后的指标观察 　　各组实验动物分别于术后2周、4周、8周、12周分别进行X 线测量、组织学及免疫组化检测、电镜分析、生物力学测定。 　　二、应用前景 　　骨折延期愈合、骨折不愈合及骨缺损的临床治疗甚为棘手，传统植骨无论是自体骨还是同种异体骨，也无论是生物骨还是人造骨，均无活性细胞，是没有生命力的死骨，需依赖于人体对植入“死骨”的改造 ，因此，成功率并不为临床满意。能否植入“活性骨”则是一个新的概念，也成为临床医生的梦想。 　　本课题采用腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因转染自体骨髓间充质干细胞，复合性状与自然骨接近但无疾病传染及来源限制之虑的纳米羟基磷灰石，制备成含有活种子细胞的组织工程化骨，观察新型组织工程化骨与其他人工骨成骨能力的差异，为新型组织工程化骨应用于临床提供实验依据。 　　本课题将为骨折不愈合及骨缺损的临床治疗提供一种全新的治疗方法，可有望广泛应用于骨折延期愈合、骨折不愈合及骨缺损的临床治疗，并解决困扰人类多年的骨替代物无活性的难题。