“豚鼠气单胞菌免疫技术研究”为福建省海洋与渔业局下达的海洋与渔业科技项目（项目编号：闽海渔科05201），属农业领域水产养殖病害防治研究方面。 项目研究的技术原理为：通过分离与鉴定欧洲鳗鲡败血症的病原菌豚鼠气单胞菌，应用杂交瘤制备单克隆抗体技术，筛选出豚鼠气单胞菌单克隆抗体细胞株，以所制备的单克隆抗体蛋白为制剂，研发豚鼠气单胞菌的快速诊断试剂盒；同时，进行抗独特型单克隆抗体细胞株的筛选，开发出豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗，对由豚鼠气单胞菌引起的水产病害采用免疫学方法进行快速诊断与防治。 项目研究内容为： （1）欧洲鳗鲡败血症病原菌豚鼠气单胞菌的分离、纯化、回归分析，鉴定； （2）应用杂交瘤制备单克隆抗体技术，筛选出抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体细胞株； （3）研制豚鼠气单胞菌的单克隆抗体快速诊断试剂盒； （4）筛选出豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体细胞株，并制备出抗独特型单克隆抗体疫苗； （5）于实验室对快速诊断试剂盒进行诊断效果分析，以及对疫苗免疫效果进行测试。 考核技术、经济指标：（1）分离出毒性强的引起欧洲鳗鲡败血症的豚鼠气单胞菌；（2）建立单克隆抗体产生细胞株3～5株，制备出能检测病原菌的单克隆抗体快速诊断试剂盒；（3）制备出抗独特型单克隆抗体细胞株2～3株，并制备出抗独特型单克隆抗体疫苗；（4）诊断盒及疫苗于实验室进行诊断和疗效试验。 考核技术、经济指标实际完成情况：（1）分离出一株强毒力致病菌：豚鼠气单胞菌AB40511NA；（2）建立单克隆抗体细胞株3株，制备快速诊断试剂盒2种；（3）制备出抗独特型单克隆抗体细胞株2株，并制备出抗独特型单克隆抗体疫苗1种；（4）2种诊断试剂盒与1种疫苗于实验室完成测试工作。 经过课题组二年多实施，完成了从患细菌性败血症的欧洲鳗鲡体中分离到一株优势菌株AB40511NA，人工感染回归试验及菌株生化鉴定证明：菌株AB40511NA即是欧洲鳗鲡细菌性败血症的强毒力致病菌，鉴定出菌株AB40511NA为豚鼠气单胞菌；完成兔抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体制备，获70 ml兔抗血清，血清效价为1:16000；进行抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体制备，采用杂交瘤技术制备了3株豚鼠气单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为0E10、1F1和1F10，对3株抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体进行特性鉴定，其亚型分别为 IgG3、IgG1、IgG2a，制备的鼠腹水效价均高达1:1×104～1:1×105，且特异性好，与常见水产致病菌均无交叉反应；进行3株单克隆抗体蛋白的中和活性鉴定，三株单抗的保护率如 下，0E10 为14.28%；1F1为85.72%；1F10为28.57%，结果表明：1F1有较强的免疫保护作用；研发出豚鼠气单胞菌单克隆抗体ELISA快速诊断 试剂盒，检测时间≤3.5 h，对豚鼠气单胞菌检测灵敏度高于5×105 cfu·mL-1。研制出豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析快速检测试纸条，检测时 间≤15 min，对豚鼠气单胞菌检测灵敏度高于1×106 cfu·mL-1；制备出2株豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体6G6和7C1，制备的鼠腹水效价均为1×10-4；竞争ELISA试验表明，6G6和7C1均能模拟豚鼠气单胞菌的抗原表位；以这2株抗独特型单克隆抗体为基础，开发出豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗，并于实验室完成豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗测试工作，在注射免疫组中，福氏完全佐剂组的作用效果最好，保护率达70%，且在免疫后6周，血液中特异性抗体效价仍较高。本项目的各项指标均已达到合同要求。 与国内外豚鼠气单胞菌病诊断与防治研究相比，该项目进行豚鼠气单胞菌单克隆抗体的制备，且研制豚鼠气单胞菌ELISA诊断试剂盒、胶体金免疫层析检测试纸条等快速、准确、便捷诊断方法；进行豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体细胞株筛选及抗独特型单克隆抗体疫苗制备、免疫效果评价。这些工作国内外均未见报道。 本项目在国内外首次以欧洲鳗鲡为对象进行豚鼠气单胞菌免疫学检测、疫苗防治研究；于国内外首次进行豚鼠气单胞菌单克隆抗体的制备；且于国内外首次研发出豚鼠气单胞菌胶体金层析快速检测试纸条和豚鼠气单胞菌ELISA快速诊断试剂盒；也是首次于国内外进行豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗制备及免疫效果评价。 本项目成果豚鼠气单胞菌ELISA快速诊断试剂盒，豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析快速检测试纸条，豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗有利于快速诊断与有效防控豚鼠气单胞菌引起的包括欧洲鳗鲡败血症等疾病，避免目前滥用抗生素防治所造成的药物残留问题、食品安全问题及环境污染等问题，为水产养殖业的健康发展提供了保障。若以鳗鲡养殖为例，我国鳗鲡年产量为20万吨左右，由豚鼠气单胞菌引起的疾病，死亡率高达5%以上，若本项目成果能够有效推广应用，则可减少经济损失上千万元。 免疫学诊断与防治是水产细菌性疾病控制发展方向，本项目研制的诊断试剂盒，对豚鼠气单胞菌的诊断快速、准确、便捷，不仅水产科研机构可以使用，而且还特别适用于基层养殖场等单位；研发的抗独特型单克隆抗体疫苗对豚鼠气单胞菌免疫效果好，保护率高；试剂盒与疫苗均适用于水产动物由豚鼠气单胞菌引起的疾病的诊断与防治，推广应用前景广阔。

“豚鼠气单胞菌免疫技术研究”为福建省海洋与渔业局下达的海洋与渔业科技项目（项目编号：闽海渔科05201），属农业领域水产养殖病害防治研究方面。 项目研究的技术原理为：通过分离与鉴定欧洲鳗鲡败血症的病原菌豚鼠气单胞菌，应用杂交瘤制备单克隆抗体技术，筛选出豚鼠气单胞菌单克隆抗体细胞株，以所制备的单克隆抗体蛋白为制剂，研发豚鼠气单胞菌的快速诊断试剂盒；同时，进行抗独特型单克隆抗体细胞株的筛选，开发出豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗，对由豚鼠气单胞菌引起的水产病害采用免疫学方法进行快速诊断与防治。 项目研究内容为： （1）欧洲鳗鲡败血症病原菌豚鼠气单胞菌的分离、纯化、回归分析，鉴定； （2）应用杂交瘤制备单克隆抗体技术，筛选出抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体细胞株； （3）研制豚鼠气单胞菌的单克隆抗体快速诊断试剂盒； （4）筛选出豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体细胞株，并制备出抗独特型单克隆抗体疫苗； （5）于实验室对快速诊断试剂盒进行诊断效果分析，以及对疫苗免疫效果进行测试。 考核技术、经济指标：（1）分离出毒性强的引起欧洲鳗鲡败血症的豚鼠气单胞菌；（2）建立单克隆抗体产生细胞株3～5株，制备出能检测病原菌的单克隆抗体快速诊断试剂盒；（3）制备出抗独特型单克隆抗体细胞株2～3株，并制备出抗独特型单克隆抗体疫苗；（4）诊断盒及疫苗于实验室进行诊断和疗效试验。 考核技术、经济指标实际完成情况：（1）分离出一株强毒力致病菌：豚鼠气单胞菌AB40511NA；（2）建立单克隆抗体细胞株3株，制备快速诊断试剂盒2种；（3）制备出抗独特型单克隆抗体细胞株2株，并制备出抗独特型单克隆抗体疫苗1种；（4）2种诊断试剂盒与1种疫苗于实验室完成测试工作。 经过课题组二年多实施，完成了从患细菌性败血症的欧洲鳗鲡体中分离到一株优势菌株AB40511NA，人工感染回归试验及菌株生化鉴定证明：菌株AB40511NA即是欧洲鳗鲡细菌性败血症的强毒力致病菌，鉴定出菌株AB40511NA为豚鼠气单胞菌；完成兔抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体制备，获70 ml兔抗血清，血清效价为1:16000；进行抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体制备，采用杂交瘤技术制备了3株豚鼠气单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为0E10、1F1和1F10，对3株抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体进行特性鉴定，其亚型分别为 IgG3、IgG1、IgG2a，制备的鼠腹水效价均高达1:1×104～1:1×105，且特异性好，与常见水产致病菌均无交叉反应；进行3株单克隆抗体蛋白的中和活性鉴定，三株单抗的保护率如 下，0E10 为14.28%；1F1为85.72%；1F10为28.57%，结果表明：1F1有较强的免疫保护作用；研发出豚鼠气单胞菌单克隆抗体ELISA快速诊断 试剂盒，检测时间≤3.5 h，对豚鼠气单胞菌检测灵敏度高于5×105 cfu·mL-1。研制出豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析快速检测试纸条，检测时 间≤15 min，对豚鼠气单胞菌检测灵敏度高于1×106 cfu·mL-1；制备出2株豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体6G6和7C1，制备的鼠腹水效价均为1×10-4；竞争ELISA试验表明，6G6和7C1均能模拟豚鼠气单胞菌的抗原表位；以这2株抗独特型单克隆抗体为基础，开发出豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗，并于实验室完成豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗测试工作，在注射免疫组中，福氏完全佐剂组的作用效果最好，保护率达70%，且在免疫后6周，血液中特异性抗体效价仍较高。本项目的各项指标均已达到合同要求。 与国内外豚鼠气单胞菌病诊断与防治研究相比，该项目进行豚鼠气单胞菌单克隆抗体的制备，且研制豚鼠气单胞菌ELISA诊断试剂盒、胶体金免疫层析检测试纸条等快速、准确、便捷诊断方法；进行豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体细胞株筛选及抗独特型单克隆抗体疫苗制备、免疫效果评价。这些工作国内外均未见报道。 本项目在国内外首次以欧洲鳗鲡为对象进行豚鼠气单胞菌免疫学检测、疫苗防治研究；于国内外首次进行豚鼠气单胞菌单克隆抗体的制备；且于国内外首次研发出豚鼠气单胞菌胶体金层析快速检测试纸条和豚鼠气单胞菌ELISA快速诊断试剂盒；也是首次于国内外进行豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗制备及免疫效果评价。 本项目成果豚鼠气单胞菌ELISA快速诊断试剂盒，豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析快速检测试纸条，豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体疫苗有利于快速诊断与有效防控豚鼠气单胞菌引起的包括欧洲鳗鲡败血症等疾病，避免目前滥用抗生素防治所造成的药物残留问题、食品安全问题及环境污染等问题，为水产养殖业的健康发展提供了保障。若以鳗鲡养殖为例，我国鳗鲡年产量为20万吨左右，由豚鼠气单胞菌引起的疾病，死亡率高达5%以上，若本项目成果能够有效推广应用，则可减少经济损失上千万元。 免疫学诊断与防治是水产细菌性疾病控制发展方向，本项目研制的诊断试剂盒，对豚鼠气单胞菌的诊断快速、准确、便捷，不仅水产科研机构可以使用，而且还特别适用于基层养殖场等单位；研发的抗独特型单克隆抗体疫苗对豚鼠气单胞菌免疫效果好，保护率高；试剂盒与疫苗均适用于水产动物由豚鼠气单胞菌引起的疾病的诊断与防治，推广应用前景广阔。